РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об’єкт досліджень та реактиви
Об’єктом досліджень був головний мозок щурів (сіра речовина). Білих безпородних
щурів утримували на стандартному раціоні віварію та забивали за допомогою
декапітації. Дослідження проводили на препаратах мікросомної фракції (МС).
В роботі використані наступні реактиви: АТР, ЕДТА, АНС («Sigma», США); DS-Na,
дитіотрейтол, уабаїн («Serva», Німеччина); імідазол («ICN Biochemicals», США);
акриламід («Reanal», Угорщина); фосфоліпаза А2 з отрути Naja naja oxiana
(«Kemotex», Естонія). Всі інші реактиви – вітчизняного виробництва кваліфікації
х.ч. або ос.ч.
2.2. Моделі алкоголізації
Примусову алкоголізацію самок білих безпородних щурів (250 - 300 г) здійснювали
в умовах вільного доступу до їжи (стандартний раціон віварію) та 20 % (об/об)
етанолу як єдиного джерела рідини в останньому триместрі вагітності
(пренатальна алкоголізація) або з першого дня лактації до 40 - 44 днів
післяпологового періоду (рання постнатальна алкоголізація). Обрані терміни
знаходяться у відповідності до критичних періодів дії алкоголю на розвиток та
етологічні показники щурів [44, 169].
Довготривалу хронічну примусову алкоголізацію самок білих безпорідних щурів
(вихідна маса ~100 г) здійснювали в умовах вільного доступу до їжи (стандартний
раціон віварію) та 15 % (об/об) етанолу, як єдиного джерела рідини протягом 4
та 15 місяців [5].
2.3. Одержання мембранних фракцій кори головного мозку щурів
Препарати МС одержували з сірої речовини головного мозку щурів методом
диференційного центрифугування згідно з Йоргенсеном-Свіднер [105, 160]. Тканину
(1/10, вага/об’єм) гомогенізували у скляному гомогенізаторі у середовищі, що
містить: 5мМ трис-HCl (рН 7,2), 0,32 М сахарозу, 1мМ ЕДТА та центрифугували при
10000 g, 20 хв. Мікросомну фракцію одержували осадженням супернатанта при 50000
g, 30 хв. Осад суспендували у середовищі гомогенізації, зберігали у cкрапленому
азоті, аліквоти разморожували одноразово.
Вельми високий рівень Na+,K+-АТР-азної активності у препаратах МС та
специфічність субклітинної локалізації цього ферменту [4] дозволяють розглядати
одержані препарати при трактуванні експериментальних результатів як фракцію
плазматичних мембран (ПМ) клітин кори головного мозку.
2.4. Визначення концентрації білка
Вміст білка визначали за модифікованим методом Лоурі з використанням 1% розчину
DS-Na для солюбілізації мембран [67].
2.5. Попередня обробка мікросомної фракції DS-Na та фосфоліпазою А2
Визначення Na+,K+-АТР-азної активності проводили після попередньої
пермеабілізації везикульованих препаратів (1,4-2,0 мг білка/мл) оптимальними
концентраціями аніонного детергента DS-Na (0,2 мг/мг білка) для виявлення
латентної АТР-азної активності у відповідності з попередніми дослідженнями
[22]. Стандартне середовище обробки МС детергентом за Йоргенсеном-Свіднер [160]
містило: 50 мМ імідазол (рН 7,5), 1-1,5 мМ ЕДТА, 3 мМ АТР. Обробку проводили
при 200С протягом 30 хв і зупиняли розведенням проби (1/10) охолодженим
розчином 50 мМ імідазолу (рН 7,5), що містив 3 мМ АТР та 1 мМ ЕДТА. Аліквоти
(50 мкл) миттєво вносили у середовище АТР-азної реакції.
В іншій серії дослідів препарати Na+,K+-АТР-ази мозку попередньо обробляли
фосфоліпазою А2 (ФЛ А2) з отрути середньоазіатської кобри. ФЛ А2 в концентрації
1 мг/мл суспендували в 20 мМ трис-НСl буфері (рН 7,4 при 200С). Аліквоти
суспензії ФЛ А2 зберігали в скрапленому азоті, одноразово розморожували і
розводили до необхідної концентрації тим же буфером [21]. Попередню обробку
проводили в середовищі, що містить 25 мМ імідазол (рН 7,5), 1 мМ СаCl2 і 10
мкг/мл ФЛ А2, при 370С протягом 30 хв. Реакцію починали додаванням препарату МС
до кінцевої концентрації білка 1 мг/мл й зупиняли десятиразовим розведенням
розчином ЕГТА (кінцева концетрація 5 мМ). Аліквоти (0,1 мл) негайно вносили в
середовище визначення АТР-азної активності.
2.6. Визначення ферментативних активностей (Na+,K+-АТР-ази, субтипів її ізоформ
та Mg2+-АТР-ази)
Загальну АТР-азну активність МС визначали у середовищі (кінцевий об’єм 1 мл),
яке містило 30 мМ трис-HCl (рН 7,4 при 370С), 130 мМ NaCl, 20 мМ KCl, 3 мМ
MgCl2, 3 мМ АТР, 0,1-0,2 мМ ЕДТА, 1,25 мМ дитіотрейтол. Mg2+-АТР-азну
активність визначали в цьому ж середовищі, але у присутності 3 мМ уабаїну, і
оцінювали за різницею до проби без білка. Час інкубації при 370С складав 10 хв.
Сумарну Na+,K+-АТР-азну активність розраховували з різниці між величинами
загальної АТР-азної (Na+,K+-АТР-аза + Mg2+-АТР-аза) та Mg2+-АТР-азної
активностей.
Активності рецепторних субтипів ізоформ каталітичної субодиниці Na+,K+-АТР-ази
визначали як компоненти сумарної Na+,K+-АТР-азної активності за чутливістю до
інгібування уабаїном. Час розвитку інгібування при 370С складав 30 хв під час
перебігу АТР-азної реакції. Активності окремих ізоформ розраховували на
підставі двохкомпонентної кривої дозозалежності інгібування ферменту [161].
Уабаїнчутливий компонент Na+,K+-АТР-азної активності, який відповідає
активності ізоформ з високою спорідненістю до уабаїну (a2 та a3), розраховували
з різниці між величинами АТР-азної активності у відсутності цього інгібітора та
за його присутності в концентрації 5 мкМ. Уабаїнрезистентний компонент
Na+,K+-АТР-азної активності (активність a1-ізоформи ферменту з низькою
спорідненістю до уабаїну) розраховували з різниці між величинами АТР-азної
активності за присутності 5 мкМ та 3 мМ уабаїну [19].
Реакцію зупиняли додавання 0,5 мл 1% розчину DS-Na. Неорганічний фосфат
визначали методом Фіске-Суббароу з аскорбіновою кислотою в якості відновника
[71]. Питома активність Na+,K+-АТР-ази МС мозку при
- Київ+380960830922