Вы здесь

Індуктивно-резонансний перенос енергії в мембранних системах

Автор: 
Доманов Єгор Олексійович
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2005
Артикул:
0405U001641
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

Розділ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Усі експериментальні дослідження проводили в 5 мМ натрій-фосфатному буфері
(рН 7,4, крім окремо згаданих випадків). Для формування ліпосом використовували
фосфатидилхолін (ФХ) і фосфатидилгліцерол (ФГ) з яєчного жовтка та кардіоліпін
(КЛ) з серця бика. Використовувалися ліпіди як вітчизняного виробництва – ЗАО
“Біолік” (Харків, Україна), так і виробництва фірми “Sigma” (Німеччина). У
дослідженнях білок-ліпідних взаємодій (розділи 5 і 6) використовували
цитохром с з серця коня виробництва “Fluka” (Німеччина), а також гемоглобін
коня і антиоксидант бутильований гідроксітолуол (БГТ) виробництва “Sigma”.
2.1. Об’єкти досліджень
Ліпосоми. Як відомо, ліпосоми являють собою замкнені ліпідні везикули, які
спонтанно утворюються у водних розчинах. При цьому один або кілька ліпідних
бішарів замикають певний об’єм водної фази, утворюючи бульбашку (рис. 2.1).
Такі структури широко використовують в біофізичних дослідженнях, тому що вони
досить добре моделюють клітинні мембрани [141-142].
Рис. 2.1. Схематичне зображення ліпосом (вигляд у поперечному розрізі). Ліворуч
– мультиламелярна ліпосома, праворуч – уніламелярна.
У даній роботі уніламелярні (тобто такі, що утворено одним бішаром) ліпосоми
із сумішей фосфатидилхоліну (ФХ) і кардіоліпіну (КЛ), в різних молярних
відношеннях, готували методом етанольної інжекції [143]. Для цього змішували
етанольні розчини ФХ (100 мг/мл) і КЛ (5 мг/мл) в необхідній пропорції і
розчиняли суміш етанолом або, навпаки, концентрували, продуваючи струменем
азоту, щоб отримати концентрацію ~25 мг/мл. Після цього суміш набирали в шприц
і з максимальною швидкістю впорскували в 15-кратний об’єм буферу при
інтенсивному перемішуванні. Перемішування продовжували ще 30 секунд після
впорскування, а потім отриману суспензію переливали в діалізний мішечок і
діалізували при перемішуванні проти 35-кратного об’єму буферу, щоб видалити
етанол. Через годину заміняли буфер свіжим і лишали діалізуватися протягом
ночі. Під час приготування ліпосом ретельно відслідковували усі об’єми для
подальшого визначення концентрації ліпіду в кінцевому препараті ліпосом
(п. 2.3.1). У більшості експериментів до суміші ліпідів також додавали 5 мол.%
бутильованого гідроксітолуолу для запобігання розвитку окислювальних процесів у
мембранах в присутності білків, що містять атоми заліза [1 Зважаючи на те, що
БГТ крім антиоксидантної активності може також мати мембрано­тропні властивості
[144], ми провели контрольні експерименти, які показали, що в умовах наших
експериментів БГТ не спричиняє суттєвого впливу на результати вимірювань.].
Готові суспензії ліпосом зберігали в холодильнику при +5°C протягом 1-2
тижнів.
Необхідно відзначити, що існують певні обмеження щодо концентрації ліпіду у
розчині, що впорскується, а також концентрації етанолу в буфері після інжекції,
які є оптимальними для формування уніламелярних ліпосом. Так, максимальна
допустима концентрація ліпіду в етанольному розчині становить 40 мМ, а
максимальна концентрація етанолу після впорскування – 7,5% [143].
Альтернативними методами приготування ліпосом є методи екструзії, озвучування
та багато інших [145]. Метод етанольної інжекції нами було обрано з наступних
міркувань. По-перше, на відміну від методу озвучування, цей метод дає
уніламелярні везикули з досить вузьким розподілом за розмірами [143]; при цьому
формування ліпосом відбувається у значно м’якіших умовах, що дозволяє запобігти
розкладу і окисленню фосфоліпідів. По-друге, метод етанольної інжекції є доволі
простим і не потребує спеціальної апаратури (напр., екструдера).
Флуоресцентно-мічені ліпіди. Донором енергії у більшості експериментів даної
роботи був флуоресцентний ліпідний аналог
1-ацил-2-[12-(9-антріл)-11-транс-додецено­їл]-sn-гліцеро-3-фосфохолін
(антрілвініл-фосфатидилхолін, АВ?ФХ), який було синтезовано доктором хімічних
наук Ю.Г. Молотковським із співробітниками (Інститут Біоорганічної хімії
ім. М.М. Шемякіна і Ю.А. Овчинникова, м. Москва) [146,147]. Структурну формулу
цього флуоресцентно-міченого ліпіду наведено на рис. 2.2. Як видно з рис. 2.2,
антрілвінільний флуорофор приєднано до кінця одного з аліфатичних "хвостів"
фосфатидилхоліну. Цей ліпідний аналог є дуже зручним в ролі донора при
дослідженні мембран методом ІРПЕ. Серед численних переваг АВ?ФХ треба
відзначити високу хімічну і фото-стійкість антрілвінілу, незалежність положення
і інтенсивності його максимуму флуоресценції від полярності оточення [148], а
також високий квантовий вихід (близько 0,8 в ліпосомах). Завдяки тому, що
антрілвінільна група є неполярною, вона локалізується в гідрофобній ділянці
бішару, і тому мало збурює структуру бішару [147]. З точки зору переносу
енергії істотною перевагою порівняно з іншими донорами є локалізація флуорофора
на чітко визначеному рівні всередині бішару. Методом 1Н?ЯМР було виявлено
[147], що кільця антрілвінілу розташовуються перпендикулярно до площини бішару
(див. рис. 5.2) близько до його центра ( нм – див. далі). Нарешті, завдяки
істотній флуоресценції в смузі Соре АВ?ФХ утворює ефективну донорно-акцепторну
пару з білками, що містять гемову групу (рис. 2.3 та 5.1).
Рис. 2.2. Хімічна структура антрілвініл-фосфатидилхоліну.
В наших експериментах АВ?ФХ додавали до суміші ліпідів в етанолі перед
інжекцією, і далі вважалося, що його молекули рівномірно розподілені між
внутрішнім і зовнішнім моношарами ліпосом. Мольна доля АВ?ФХ у мембрані не
перевищувала 0,35%.
Білки. В експериментальній частині даної роботи вивчалися взаємодії
водорозчинних гем-білків цитохрому с і гемоглобіну з фосфоліпідними мембра