РОЗДІЛ 2
ОРГАНІЗАЦІЯ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Вибір напряму та методики досліджень
Дослідження проводились у відділі біотехнології Технологічного інституту молока
та м’яса УААН. Технології виробництва бактеріальних препаратів для
функціональних молочних продуктів було опрацьовано в умовах Державного
дослідного підприємства бактеріальних заквасок ТІММ (м. Київ) та на
молокозаводах України (м. Лубни, м. Макаров, м. Суми, м. Жидачів).
Схема проведення досліджень представлена на рис. 2.1.
Було застосовано традиційні та оригінальні методи досліджень, проведено
статистичну обробку результатів.
2.2. Об’єкти досліджень
Культури мікроорганізмів. Чисті культури молочнокислих бактерій видів
Streptococcus salivarius ssp. thermophilus, Lactobacillus acidophilus,
Lactobacillus сasei ssp. сasei. Культури молочнокислих бактерій підтримували за
температури 36 єС у 10 % стерильному знежиреному молоці, поновлюючи їх через
кожні 20-25 днів. Зберігали за (2-6) оС.
Тест-культури патогенних та умовно патогенних культур. В роботі використано
штами патогенних та умовно патогенних бактерій з музею відділу біотехнології
ТІММ та з колекції Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В.
Громашевського АМН України родів: Salmonella, Staphylococcus, Shigella,
Proteus, Pseudomonas, Escherichia, Candida, Enterococcus.
Культури клітин. У дослідах використовували перещеплювальну клітинну лінію
епідермоїдної аденокарциноми гортані людини HЕp-2, яка була надана для
проведення досліджень д.м.н. В.І. Задорожною (ІЕІХ АМНУ).
Дослідні тварини. Досліди на тваринах проводили у віварії ІЕІХ АМНУ. Було
використано 40 білих безпородних мишей вагою 25-27 г.
Рис. 2.1. Схема проведення експериментальних досліджень.
МКБ - молочнокислі бактерії, БП – бактеріальний препарат
2.3. Методи досліджень
2.3.1. Методи досліджень біологічної активності бактерій in vitrо.
Антагоністичну активність молочнокислих бактерій по відношенню до тест-культур
патогенних і умовно патогенних мікроорганізмів досліджували in vitro за методом
лунок, вимірюючи розмір зон відсутності росту тест-культур на твердому
поживному середовищі у мм [181]. За методом спільного культивування
лактобактерій з тест-культурами у рідкому середовищі визначали титр
антагоністичної активності (індекс антагоністичної активності) – найбільше
розведення бактеріальної суміші після культивування протягом 24 год, з якого
висівається тест-культура [182].
Гідрофобність клітин молочнокислих бактерій визначали за методом, який
ґрунтується на здатності мікроорганізмів розподілятися у біфазній системі
“суспензія мікроорганізмів:н-гексадекан” [52]. Метод здійснювали наступним
чином: У дві паралельні пробірки вносили по 18 см3 суспензії мікроорганізмів з
оптичною густиною 0,5-0,6 од (л=450 нм), додавали по 0,6 см3 н-гексадекану
(дослід) та фізіологічного розчину (контроль). Пробірки інтенсивно струшували
протягом 1хв, залишали у спокої на 10 хв для остаточного розшарування фаз.
Після цього вимірювали оптичну густину водної фази суспензії. Гідрофобність
клітин виражали у відсотках і визначали за відношенням оптичної густини
суспензії після взаємодії з н-гексадеканом до її вихідного значення.
Електрокинетичні дослідження поверхневих структур клітин проводили на установці
для мікроелектрофорезу. Культури молочнокислих бактерій нарощували у
середовищах МРС і ГБ протягом 18 годин. Клітини відділяли від культуральної
рідини центрифугуванням при 3000 об./хв протягом 15 хв та двічі промивали
стерильною дистильованою водою (рН 6,6). Вимірювали швидкість електрофоретичної
рухливості 30-ти клітин у електричному полі (10 В/см, 6,7 мА) [183].
Здатність до адгезії. Адгезію мікроорганізмів досліджували у двох модельних
системах: із гранулами скла та на клітинній культурі аденокарциноми гортані
людини НЕр-2. Перша з них імітує неспецифічну адгезію, друга – специфічну. Під
час визначення неспецифічної адгезії скляні колонки діаметром 15 мм заповнювали
хімічно чистими скляними гранулами діаметром близько 1 мм (5 г) та додавали 5
см3 суспензії культур мікроорганізмів, оптична густина якої становила 0,7-0,8
од (л=540 нм). Контролем слугувала колонка з суспензією бактерій без скляних
гранул для підрахунку клітин, які закріпилися на її стінках. Через 30 хв
суспензію клітин зливали у мірний посуд, колонку двічі промивали фізіологічним
розчином для вилучення незакріплених клітин. Контрольний та дослідний об’єми
суспензій доводили до 10 см3 фізіологічним розчином і вимірювали оптичну
густину суспензії. Адгезивну здатність бактерій визначали за часткою
закріплених клітин від вихідної кількості.
Адгезію на перещеплювальній клітинній культурі НЕр-2 визначали, використовуючи
добову клітинну культуру, вирощену на покривних скельцях у чашках Петрі.
Мікроорганізми готували, як наведено вище, а густину суспензії – за оптичним
стандартом мутності з розрахунку 109 клітин у 1 см3. У стерильну чашку Петрі
вносили покривне скельце з відмитою клітинною культурою та суспензією
мікроорганізмів (10 см3). Інкубували протягом 1 год за кімнатної температури.
Після цього скельця промивали 8 разів у фізіологічному розчині для вилучення
незакріплених бактерій, висушували, фіксували та фарбували метиленовим синім. У
оптичному мікроскопі підраховували кількість мікроорганізмів, що закріпилися на
клітинах культури НЕр-2. Для достовірності результатів проглядали не менше 100
клітин НЕр-2. Ступінь адгезивності мікроорганізмів виражали за індексом
адгезивності (ІА) – середньою кіль