Ви є тут

Створення букального препарату з інсуліном та оцінка його ефективності при корекції стоматологічних порушень у хворих на діабет 1-го типу

Автор: 
Старокадомський Петро Львович
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2006
Артикул:
0406U000021
129 грн
Додати в кошик

Вміст

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
2.1. Виготовлення та характеристика лізальбінату
2.1.1. Виготовлення лізальбінату. Для одержання лізальбінату застосовувалась
удосконалена методика на основі методу, описаного у роботі [70]. До гарячого
розчину 15 г NaOH у 500 мл води додавали невеликими порціями при перемішуванні
100 мг яєчного альбуміну. Отриманий розчин нагрівали 1 год на киплячій водяній
бані. Реакційну суміш охолоджували до кімнатної температури і фільтрували. До
фільтрату невеликими порціями при перемішуванні додавали 40-50 % сірчану
кислоту до кінцевого рН 5. Осад відокремлювали за допомогою фільтрування через
паперовий фільтр та двічи промивали водою (по 20 мл). Фільтрат діалізували
проти великого об’єму дистильованої води протягом 48 годин. До діалізату, що
містить сульфат лізальбінату, порціями додавали водний розчин гідроксиду барію
(баритова вода). Нейтралізацію проводили доти, доки в пробі фільтрату не будуть
відсутні як аніони SO42-, так і катіони Ba2+, про що свідчило припинення
випадання осаду BaSO4. Осад сульфату барію фільтрували через паперовий фільтр.
Сильно пінливий водний розчин лізальбінату ліофільно висушували при -20оС
(ліофільна сушка Jouan Heto DW 8-85). Отриманий порошок двічі промивали 10 мл
96 % етилового спирту і просушували на повітрі. Вихід лізальбінату складав
20-25 мг з 100 мг альбуміну. Наведена методика легко масштабується шляхом
збільшення об’ємів реагуючих речовин.
2.1.2. Визначення молекулярної маси лізальбінату за допомогою гель-фільтрації.
Дослідження молекулярної маси препаратів лізальбінату проводили за допомогою
гель-фільтрації на Sephadex G-75 (Reanal), врівноважена 20 мМ Трис-HCl, pH 7,5.
Швидкість току елюенту складала 3 мл/хв. Характеристики колонки – висота – 53
см, діаметр – 2,5 см, Vo=70 мл, Vфракції=15 мл. Для аналізу наносили Vstart=7
мл. Колонка калібрувалась за допомогою наступних речовин-маркерів: глюкоза (180
Да), актиноміцин (1200 Да), міоглобін (17,8 кДа), бичачий сироватковий альбумін
(68 кДа).
2.1.3. Визначення молекулярної маси лізальбінату за допомогою
диск-електрофорезу в ПААГ. Електрофоретичне дослідження молекулярної маси
препаратів лізальбінату проводили у ПААГ за допомогою стандартних методик [82]
з використанням молекулярних маркерів фірми Fermentas.
2.1.4. Визначення залежності поверхневого натягу розчину від концентрації
лізальбінату. Визначення поверхневого натягу у проводили за допомогою методу
відриву кільця (метод Дю Нуі) [83]. За результатами будували графік, де по осі
ординат відкладали значення у•103, а по осі абсцис – lnС (% м/об).
2.1.5. Визначення критичної концентрації міцелоутворення (ККМ) лізальбінату за
допомогою кондуктометрического методу. Вимір питомої електропровідності
розчинів лізальбінату проводили за методом, наведеним у роботі [84]. За
результатами будують графік залежності питомої електропровідності від
концентрації С (% м/о) для розчинів лізальбінату та по зламу кривої знаходили
ККМ.
2.2. Дослідження букальної проникності білків на моделі защічних мішків хомўяка
2.2.1. Виділення защічних мішків хом'яка. Хом'яка забивали під ефірним наркозом
шляхом тотального кровопускання. Виділені защічні мішки хом'яків тричі
промивали розчином Рінгера (0,154 М NaCl, 0,154 М KCl, 0,11 М CaCl2, 0,154 М
KH2PO4, 0,154 М MgSO4•7H2O, 0,154 М NaHCO3) при кімнатній температурі.
Виділений мішечок обережно вивертали навиворіт, слизовою стороною назовні, і
негайно використовували.
У вивернутий ізольований защічний мішок хом'яка наливали 1 мл чистого розчину
Рингера і занурювали у розчин Рінгера з досліджуваною речовиною при кімнатній
температурі. Концентрація досліджуваної речовини в розчині Рінгера складала
4,4•10-5-3,1•10-4 мМ. Туди ж додавали лізальбінат (ЛК) у концентрації 0,2–10 %
(мас). Інкубацію проводили на водяній бані при 37оС і постійному перемішуванні.
Через визначені проміжки часу (1-15 хв) з мішечка відбирали проби для
подальшого аналізу.
2.2.2. Аналіз проб за допомогою колориметричної реакції. Визначення відносної
концентрації пероксидази (Sigma) проводилося за допомогою колориметричної
реакції з 3,3',5,5'-тетраметилбензидином (ТМВ) (Amersham). Вихідна концентрація
пероксидази у розчині Рінгера складала 4,5•10-5 мМ, концентрація ЛК 0,2-10 %.
Як контроль використовували розчин пероксидази без ЛК. Щохвилини на протязі 15
хв з мішечка відбирали пробу (50 мкл), додавали рівну кількість ТМВ, через 1 хв
реакцію зупиняли додаванням 50 мкл 0,05 М сірчаної кислоти. Відносну
концентрацію пероксидази у пробах визначали за допомогою приладу Multiscan
MCC/340P на довжині хвилі 450 нм.
2.2.3. Аналіз проб за допомогою диск-электрофорезу в ПААГ. Вихідна концентрація
б-інтерферону (ПНДК «Фарм Біотек») у розчині Рінгера складала 3.1•10–4 мМ,
концентрація ЛК 1-5 %. Як контроль використовували розчин a-інтерферону без ЛК.
Щохвилини протягом 15 хв з мішечка відбирали пробу (50 мкл) для аналізу.
Кількісне визначення б-інтерферону проводилося за допомогою диск-электрофореза
в 16 % поліакриламіді гелі за стандартною методикою у присутності маркерних
білків [82]. Гелі, пофарбовані Coomassie R250, сканували за допомогою сканера
HP Deskjet Professional. Концентрацію білка визначали на персональному
компьютері за допомогою програми TotalLab 2.01, порівнюючи інтенсивність
забарвлення полоси, яка відповідала б-інтерферону з маркерними білками,
концентрація яких була відомою.
2.2.4. Аналіз проб за допомогою флуоресцентних міток. Інсулін (ЗАТ «Індар»)
мітили ізотіоцианатом флюоресцеїну (ФІТЦ) за методикою, описаною у роботі [85].
Концентрація інсуліну в розчині Рінгера складала 3,44•10–4 мМ, концентрація ЛК
- 5 %. Як контроль використовували розч