РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И Методы исследования
Для достижения поставленной цели в работе использовали следующие методы
теоретической физики и математические методы. Вычисление свободной энергии
деформированной мембраны осуществлялось методами теории упругих конечных
деформаций тонких многослойных оболочек [204], термодинамики многокомпонентных
растворов [205], статистической физики [206] и дифференциальной геометрии
поверхностей [207,208]. Для анализа условий возникновения белкового домена в
изотропно растянутой мембране и определения формы контура деформированной путем
изгиба клетки использовали аппарат равновесной термодинамики [205] и
вариационного исчисления [209]. При формулировке теоретической модели
эндоцитоза кроме перечисленных выше методов использованы некоторые положения и
принципы неравновесной термодинамики [210] и синергетики [6].
В отличие от классической теории упругости [211] в теории упругих конечных
деформаций тонких оболочек [212] рассматриваются деформации, при которых форма
мембраны может значительно изменяться. Однако, при этом, как и в классической
теории упругости, напряжения, возникающие в мембране при ее деформации,
считаются малыми. Очевидно, теория упругих конечных деформаций более адекватно
описывает реакцию биомембран на действие внешних нагрузок, так как, в
частности, форма клеточной мембраны может сильно измениться при сравнительно
небольших изменениях параметров окружающей мембрану среды, тогда как, как
правило, даже сравнительно небольшое растяжение площади поверхности и,
соответственно, небольшое натяжение мембраны приводит к ее разрыву.
Экспериментально установлено, что мембрана клеток в широком диапазоне внешних
нагрузок, если они являются не слишком продолжительными и большими, ведет себя
как упругое твердое тело, то есть восстанавливает первоначальную форму и
размеры после прекращения внешнего воздействия [204]. На основании
экспериментальных данных в первом приближении можно считать, что мембранный
монослой практически не оказывает сопротивления изменению его формы при
неизменной площади и в то же время значительно в меньшей степени поддается
растяжению или сжатию при постоянной форме. В то же время молекулы, из которых
состоит бислойная биологическая мембрана, могут сравнительно легко перемещаться
путем диффузии вдоль ее монослоев. Таким образом, монослой мембраны можно
рассматривать как двумерный раствор и использовать для описания его свойств
двумерные аналоги термодинамических соотношений и законов статистической
физики, справедливых для обычных многокомпонентных растворов. Ввиду чрезвычайно
малой толщины монослоев можно рассматривать их как поверхности и описывать
деформацию каждого из монослоев как изменение метрики и кривизны
соответствующей поверхности, то есть как изменение ее первой и второй
квадратичной форм, возникающее в результате деформации.
В качестве одного из основных методических принципов в работе применен
известный в равновесной термодинамике принцип минимума свободной энергии. Время
установления механического равновесия по порядку величины определяется
отношением характерного размера изучаемого объекта к скорости распространения
звука в нем и поэтому, как правило, чрезвычайно мало по сравнению с характерным
временем установления теплового и химического равновесия. Следовательно, можно
считать отклонение исследуемой мембраны от механического равновесия малым и
считать, что в каждый момент времени свободная энергия деформации клеточной
мембраны принимает минимально возможное при заданных внешних условиях
значение.
При формулировке теоретической модели эндоцитоза в работе в самом общем виде
использовали современные представления синергетики о пространственно-временной
организации жизнедеятельности клеток, связанной с протекающими в клетках
нелинейными неравновесными биохимическими процессами.
При численном моделировании процесса эндоцитоза и для решения системы
дифференциальных уравнений, описывающих форму контура изогнутой мембраны,
применяли стандартный метод Рунге – Кутта четвертого порядка.
Исследования морфологического ответа изолированных гепатоцитов крысы на
последовательное изменение осмотичности внеклеточной среды, моделирующее
процессы дегидратации и регидратации клеток, проведены методом световой
микроскопии на микроскопе МБИ-15-У с фотографической регистрацией.
Гепатоциты выделялись из печени крыс по методу, описанному в работе [213]. В
качестве гипертонического реагента использовали проникающее в клетки вещество -
диметилсульфоксид (ДМСО) в концентрации 15, 20% вес/объем. Растворы
криопротектора готовили на среде следующего состава: 250мМ сахароза, 5мМ КСI,
0,4мМ KH2PO4, 0,4мM NaHPO4 0,8мМ MgSO4, 1,2мМ CaCI2, 10мМ трис, 1% альбумин.
Снижение осмотического давления внеклеточной среды после гипер-тонического
воздействия на клетки достигалось путем дозированного добав-ления к суспензии
клеток дистиллированной воды.
Все экспериментальные манипуляции проводили непосредственно на столике
микроскопа, что позволяло регистрировать осмотическую реакцию клеток
практически с первых минут наблюдения. Для этой цели была сконструирована
специальная камера, представляющая собой предметное стекло с прорезанной в нем
канавкой, один конец которой имеет вход в ячейку с клеточной суспензией. Объем
ячейки, составляющий 5 Ч 18 Ч 0,30мм3 (27,0мкл), создавался закрепленными на
предметном стекле покровными стеклами. Суспензию клеток вносили в канавку, по
которой благодаря действию капиллярных сил она попадала в ячейку. Таким же
образом добавляли соответствующие гипертоничес
- Київ+380960830922