РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Методика дослідження електричних параметрів мембран зародків в’юна
2.1.1. Характеристика об’єкту дослідження. Об’єктом наших досліджень були
зародки прісноводної риби в’юна Misgurnus fossilis L.
Для проведення експерименту використовувались яйцеклітини і зародки в’юна
Misgurnus fossilis L., які отримували за методикою Нейфаха [207]. У
лабораторних умовах риб утримували в холодильнику при температурі +4-5оС. Для
отримання ікри самкам дом’язово вводили 500 МО хоріогонічного гонадотропіну.
Овуляція наступала через 36 годин при температурі +19-20оС.
Зиготи починали інкубувати при температурі +20-22оС в розчині Гольтфретера.
Стадії розвитку контролювали візуально під бінокулярним мікроскопом МБС-9.
Після однієї години інкубації зиготи при температурі 21,5оС з’являються перші
два бластомери зародка, причому борозна першого поділу дроблення проходить
меридіально. У подальшому вік зародків вимірювали або часом після запліднення,
або номером поділів бластомерів, або числом фо – умовних одиниць “детлаф”, що
дістали назву на честь авторів, які їх запропонували [95]. Величина фо – це
тривалість одного мітотичного циклу в період синхронних дроблень 2-4
бластомерів, яка для в’юна при температурі 21,5оС складає 31 хв. Так, через 1,5
год після запліднення, або через 3 фо, відбувається ІІ поділ: кількість
бластомерів – 4. Борозна другого поділу теж меридіальна, але проходить
перпендикулярно до борозни першого дроблення. Через 2 год (4 фо, ІІІ поділ)
зародки мають 8 бластомерів, а через 2,5 год (5 фо, ІV поділ) – 16, причому і
ці борозни проходять меридіонально і перпендикулярно попереднім. Через 3 год (6
фо, V поділ) зародки представлені 32 бластомерами, але борозна п’ятого поділу
проходить паралельно екватору жовтка, в результаті чого на анімальному полюсі
утворюється “шапочка”, тобто бластодиск, клітини якого ще не відділені від
жовтка мембранами. Після 3 год клітини нижнього шару торкаються жовтка
безпосередньо своєю базальною частиною, а верхні оточені з усіх боків
плазматичними мембранами. Вперше з’являються якісні відмінності між
бластомерами [70]. На наступній стадії дроблення (7 фо, VI поділ) зародок має
64 бластомери, які розташовані 2-3 шарами і утворюють “високу шапочку”. Через 4
год після запліднення (8 фо, VII поділ) зародки мають 128 бластомерів, через 5
год (10 фо, IX поділ) – 512 бластомерів, що утворюють морулу. Після цієї стадії
поділу відбувається десинхронізація каріокінезу в різних клітинах, а на стадії
12 фо (XI поділ) формується рання бластула – “шапочка” бластомерів здіймається
над жовтком, зовнішні бластомери утворюють епібласт. На цій стадії починається
асинхронний поділ ядер, падає мітотичний індекс. Починається інтенсивний синтез
РНК і морфогенетична функція ядер [216].
Саме на цій стадії – через 6 год після запліднення, ми закінчували реєстрацію
трансмембранного потенціалу зародків, оскільки в цей час починається
десинхронізація коливань ТМП, яка співпадає з десинхронізацією поділів ядер.
Для проведення електрофізіологічних досліджень зародки в’юна вивільняли від
перивітелінових оболонок механічним способом, за допомогою гострозаточених
препарувальних голок. Процедуру вивільнення проводили в чашках Петрі під
бінокулярним мікроскопом МБС-9.
2.1.2. Експериментальна установка для неперервної реєстрації ТМП зародків
в’юна. Вимірювання та реєстрацію трансмембранного потенціалу клітин зародків в
період дроблення бластомерів проводили на спеціально зібраній установці, схема
якої представлена на рис. 2.1.
Вивільнені від перивітелінової оболонки зародки пастерівською піпеткою
переносили в камеру з оргскла (об’єм 0,5 мл), конструкція якої дозволяє
проводити зміну розчину із швидкістю 0,2 мл/хв при довготривалих дослідах.
Мікроелектроди закріплювали в тримачі механічних мікроманіпуляторів виробництва
Пущинського НВП “Биоприбор” (Пущино) і, контролюючи топографію введення під
об’єктивом мікроскопа МБС-9, вводили їх в зародок. Мікроелектрод являє собою
мікропіпетку з внутрішнім капіляром зі скла “Пірекс” (Швеція), з діаметром
кінчика < 1 мкм. Опір мікроелектродів становив близько 10 МОм.
Рис. 2.1. Схема автоматизованої установки для дослідження електрофізіологічних
характеристик мембран зародків в’юна:
1 – експериментальна камера;
2, 4 – мікроелектродні підсилювачі;
3 – підсилювач струму;
5 – підсилювач фіксації потенціалу;
6 – підсилювач-перетворювач;
7 – потенціометри КСП-4.
Електроди заповнювали 2,5 М розчином хлориду калію через фільтрувальну насадку
з діаметром пор 0,2 мкм [163]. Як індиферентний електрод використовували
порівняльний електрод від pH-метра, заповнений насиченим розчином KCl.
При проведенні експерименту в камеру з оргскла з інкубаційним середовищем
вносили розчини солей важких металів в концентраціях від 1Ч10–6 М до 1Ч10-4 М,
які виготовляли на основі фізіологічного розчину для холоднокровних – розчину
Гольтфретера (табл. 2.1), і проводили реєстрацію трансмембранного потенціалу,
зміненого під дією іонів важких металів.
Реєстрацію рівня мембранного потенціалу проводили на цій установці безперервно,
протягом 6-7 год розвитку зародків. Реєстрація здійснювалась за допомогою
підсилювачів, які були зібрані на базі інтегральних мікросхем К544 УДІА за
принциповими схемами, запропонованими у роботах Костюка, Магури та Первіса
[165, 182, 220]. Запис електричних сигналів, отриманих на виході підсилювача,
проводили на стрічках потенціометрів КСП-4.
Таблиця 2.1
Хімічний склад фізіологічного розчину для холоднокровних –
розчину Гольтфретера [27]
Складники
Маса солей на 100 мл маточного розчину, мг
Об’єм маточного розчину на 1 л готового розч
- Київ+380960830922