РОЗДІЛ 2 МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Спектральні методи дослідження
Реєстрація спектрів флуоресценції і спектрів збудження. Спектри кальційчутливих зондів індо-1 і род-2 та рН-чутливого зонда BCECF в розчинах та в суспензії тимоцитів, записувались на спектрофлуориметрі
СДЛ-2. Флуоресценцію індо-1 збуджували на довжині хвилі ?зб=350 нм. Флуоресценцію род-2 збуджували на довжині хвилі ?зб=530 нм Спектри збудження BCECF реєстрували на ?р=535 нм. Флуоресценція індо-1, род-2 та BCECF реєструвалась під кутом 90? до променя збуджуючого світла з 1 см кювети в спектральному інтервалі від 360 до 600 нм, від 560 нм до 700 нм та від 360 до 530нм, відповідно, з смугою пропускання 0.5 нм на монохроматорі флуоресценції. Концентрації індо-1, род-2 та BCECF в розчинах мали величини 5 мкМ, 0,5 мкМ та 0.5 мкМ, відповідно. Спектри записувались та зберігались в ASCII кодах з можливістю подальшої обробки за допомогою спеціалізованого програмного забезпечення.
Коригування спектрів флуоресценції. В спектрофлуориметрі СДЛ-2 не реалізований контроль за стабільністю роботи лампи ДКСШ-150, а також відсутнє коригування спектрів випромінювання за допомогою порівняльного (опорного) каналу. Недоліком ксенонової лампи ДКСШ-150, яка використовується в даному спектрофлуориметрі, є її нестабільність, яка зумовлена зміщенням розряду відносно електродів лампи та зміною його форми. Значні флуктуації інтенсивності збуджуючого випромінювання, призводять до спотворення досліджуваних спектрів флуоресценції. Апаратно-програмний комплекс на базі комп'ютера ДВК-2м, за допомогою якого здійснюється управління роботою спектрофлуориметра, фізично застарів. Комп'ютер ДВК-2м має програмне забезпечення, яке не передбачає потрібного нам рівня математичної обробки спектрів, а IBM-несумісні носії магнітної інформації унеможливлюють математичну обробку спектрів за допомогою сучасного програмного забезпечення. З огляду на викладені обставини, нами була удосконалена апаратно-програмна частина спектрофлуориметра та розроблено цифровий метод зменшення впливу флуктуацій збуджуючого випромінювання, який є модифікацією методів усереднення фотоструму [?3].
Метод полягає в автоматичному регулюванні тривалості часових інтервалів інтегрування фотоструму відповідно до зміни інтенсивності збуджуючого випромінювання. Реєстрація спектрів флуоресценції зондів здійснюється шляхом перетворення величини інтенсивності кожної поточної спектральної складової у відповідний цифровий код, який реєструється за допомогою цифрового реєструючого пристрою. При цьому кванти флуоресценції за допомогою фотоелектронного помножувача (ФЕП) перетворюються в стохастичну послідовність одноелектронних імпульсів, які підсилюються і нормуються по амплітуді. Середня частота появи нормованих імпульсів fф пропорційна інтенсивності флуоресценції Іф. Інтегрування фотоструму здійснюється шляхом підрахунку стохастичних нормованих імпульсів протягом певного проміжку часу цифровим реєструючим пристроєм. Кількість імпульсів N, яка підрахована впродовж одного періоду інтегрування, утворює цифровий код інтенсивності флуоресценції, величина якого дорівнює добутку середньої частоти появи нормованих імпульсів fф на тривалість періоду інтегрування Т.
Зміна інтенсивності флуоресценції, яка обумовлена флуктуацією збуджуючого випромінювання, спричинить відповідну флуктуацію цифрового коду N, що призведе до спотворення результатів. Вплив флуктуації на величину N можна скоригувати, змінюючи відповідним чином час інтегрування в залежності від інтенсивності збуджуючого світла. При цьому підрахунок імпульсів буде вестися не впродовж всього інтервалу інтегрування Т, а тільки в певній його частині, у, так званому, "вікні", тривалість якого береться обернено пропорційною інтенсивності збуджуючого світла І0. Тоді відкоригована кількість імпульсів Nk, яка підрахована протягом періоду інтегрування Т, становитиме частину величини N, що пропорційна відношенню ?/T або відношенню середньої інтенсивності флуоресценції Ітм до збуджуючого світла І0 за період Т:
(2.1)
де ? -коефіцієнт пропорційності. Якщо за відсутності флуктуацій вибрати величину ? рівною половині інтервалу інтегрування Т, то це дасть можливість здійснювати коригування цифрового коду, як в сторону збільшення, так і в сторону зменшення інтенсивності збуджуючого світла І0.
Для технічної реалізації запропонованого методу додатково до інформаційного каналу вводиться опорний канал та електронний ключ. Опорний канал ділить час вимірювання поточної спектральної складової на ряд однакових інтервалів інтегрування і формує в кожному з них вікно для підрахунку імпульсів з інформаційного каналу. Початок роботи вікна фіксований у часі і збігається з початком інтервалу інтегрування. Впродовж роботи вікна на виході опорного каналу утримується високий рівень потенціалу, який забезпечує безперешкодне проходження через електронний ключ нормованих імпульсів, що поступають з інформаційного каналу. Тривалість сформованого вікна є пропорційною інтенсивності збуджуючого випромінювання. Решту періоду інтегрування на виході опорного каналу утримується низький рівень потенціалу, який закриває електронний ключ, перешкоджаючи проходженню імпульсів з інформаційного каналу і коригуючи таким чином величину цифрового коду, зареєстрованого лічильним пристроєм. Структурна схема, що відтворює технічну реалізацію даного методу, наведено на рис. 2.1.
Фотоелектричний помножувач 4 перетворює кванти флуоресценції, що надходять від зразка 2, в послідовність одноелектронних імпульсів, які підсилюються підсилювачем 5. Нормування підсилених імпульсів по амплітуді здійснюється компаратором 6. Ці елементи складають інформаційний канал. Генератор 9 утворює короткі прямокутні імпульси стабілізованої частоти, які визначають інтервали інтегрування. Переднім фронтом кожного такого імпульсу на виході D-тригера встановлюється високий рівень потенціалу, який переводить попередньо очищений лічильник 8 в режим підрахунку імпульсів. Лічильник