<p>Глава 2<br />общая методика и основные методы исследования<br />2.1. Объект исследования<br />Работа выполнена на классическом объекте генетических исследований – плодовой<br />мушке – Drosophila melanogaster Meig. Материалом исследования служили личинки,<br />предкуколки и имаго линий дрозофилы из коллекции кафедры генетики и цитологии<br />Харковского национального университета имени В.Н. Каразина, линии дрозофилы,<br />полученные из других генетических лабораторий. <br />Инбредные линии дикого типа Oregon-R (Or-R) (инбридинг 102-105 поколений) и<br />Swedish (Sw) (инбридинг 98-103 поколения) инбредировались на протяжении многих<br />поколений путем скрещивания сибсов; в работе использовались при исследовании<br />влияния генотипа на количественные признаки в онтогенезе и линия дикого типа<br />Oregon-R (инбридинг 80-100 поколений) при действии метопрена. <br />Инбредная мутантная линия forked (f) (инбридинг 105-125 поколений):<br />локализация мутации 1-56.7; делеция; рецессивная; гомозиготы жизнеспособны;<br />фенотипически проявляется в укороченных или опаленных щетинках [175];<br />инбредировалась на протяжении многих поколений путем скрещивания сибсов; в<br />работе использовалась при исследовании влияния генотипа на количественные<br />признаки в связи с действием гормона в питательной среде. <br />Реципрокные гибриды F1 между инбредными линиями дикого типа Oregon-R и<br />Swedish, а также между инбредной линией дикого типа Oregon-R и инбредной<br />мутантной линией forked. <br />Материалом также служила неселектируемая линия Oregon-R при исследовании<br />влияния гормонов развития на пуфинг, степень политении хромосом и проявление<br />количественных признаков у дрозофилы. <br />Выбор выше перечисленных линий дрозофилы обусловлен тем, что они генотипически<br />различны и являются контрастными по приспособленности. <br />2.2. Методы исследования<br />При проведении всех экспериментов культуру дрозофилы поддерживали по<br />общепринятой методике. Мухи развивались на стандартной сахарно-дрожжевой среде<br />в стаканчиках диаметром 2,0 см и высотой 10,0 см (объем питательной среды в<br />каждом стаканчике составлял 5 мл) при температуре 22-24 єС, в условиях<br />термостата. <br />Исследовали влияние аналога ювенильного гормона – метопрена (ювемона) на<br />активность пуфов онтогенеза, степень политении хромосом, биоэлектрические<br />свойства клеточных ядер слюнных желез дрозофилы и адаптивно важные признаки<br />(теплоустойчивость, массу тела, выход имаго, длительность предимагинальных<br />стадий онтогенеза). <br />Метопрен является инсектицидом гормонального действия, подавляющим превращение<br />личинок или нимф насекомых в жизнеспособные взрослые особи, а также обладающий<br />овицидным действием. Препарат нетоксичен для теплокровных; используется для<br />борьбы с кровососущими комарами, мухами, блохами, домовыми муравьями и другими<br />насекомыми – переносчиками болезней, для уничтожения эктопаразитов скота,<br />вредителей зерна, муки и сухой растительной с/х продукции, в шелководстве для<br />увеличения производительности шелковичных червей и выхода шелка. По химической<br />природе ювемон представляет собой изопропиловый эфир 11-метокси-3, 7,<br />11-триметил-2-транс-4-транс-додекадиеновой кислоты <br /> ОСН3 СН3 СН3<br />(СН3)2ССН2СН2СН2СНСН2СН=СНС=СНСООСН(СН3)2 [82].<br />При воздействии метопрена на пуфинг и биоэлектрические свойства клеточных ядер<br />дрозофилы условия эксперимента включали 4 варианта: контроль 1 (слюнные железы<br />без инкубации, которые после извлечения на стадии 0-часовой предкуколки сразу<br />же подвергали окрашиванию); контроль 2 (инкубация слюнных желез в 1 % растворе<br />DMSO с экспозицией 30 минут при 24°С; в опыте 1 и опыте 2 слюнные железы<br />инкубировали в растворах метопрена в концентрациях 0,1 и 1мкг/мл соответственно<br />в 1 % растворе DMSO в течение 30 минут при 24°С. <br />Выбор данного растворителя обусловлен тем, что метопрен практически нерастворим<br />в воде и растворим в большинстве органических растворителей, а также в жирах и<br />растительных маслах. При выборе концентрации гормона и экспозиции воздействия<br />учитывали, что подобные условия для другого аналога ювенильного гормона<br />использовались ранее в работах на Drosophila virilis [111], а также тот факт,<br />что ЮГ проявляет свою активность в концентрации на 1-2 порядка ниже, чем<br />экдистерон. <br />Для определения различий по массе тела имаго использовали показатель массы 100<br />особей. Измеряли данный показатель с помощью торсионных весов. Возраст имаго<br />составлял от 8 часов до 1 суток. <br />2.2.1. Метод приготовления ацетоорсеиновых препаратов политенных хромосом. <br />Политенные хромосомы двукрылых насекомых, функционирующие как интерфазные,<br />являются прекрасным модельным объектом для исследования организации и<br />функционирования генома эукариот, как в онтогенезе, так и при различных<br />экзогенных воздействиях [2, 3, 33, 37, 50, 203]. <br />Политенные хромосомы дрозофилы исследовали на давленных ацетоорсеиновых<br />препаратах слюнных желез, приготовленных по стандартной методике [60, 68].<br />Слюнные железы личинок и предкуколок извлекали в капле физиологического<br />раствора Эфрусси-Бидла (7,5 г NaCl, 0,35 г KCl, 0,21 г CaCl2, 1000 мл Н2О) под<br />микроскопом МБС-1 с помощью двух препаравальных игл. После инкубации в<br />экспериментальных средах железы в течение 3-4 часов фиксировали и окрашивали в<br />капле 2 %-ного ацетоорсеина, приготовленного на смеси равного количества 85<br />%-ной молочной кислоты и ледяной уксусной кислоты. После окрашивания слюнные<br />железы переносили на предметное стекло и отмывали от краски 45 %-ной уксусной<br />кислотой. Затем добавляли по капле 85 %-ной молочной кислоты и 45 %-ной<br />уксусной кислоты. После этого слюнные железы накрывали покровным стеклом и<br />раздавливали, прижимая покровное стекло к предметному. <br />2.2.2. Анализ пуфовой активности полите</p>
- Київ+380960830922