<p>РАЗДЕЛ 2<br />МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ<br />2.1. Постановка задачи<br />В соответствии с поставленными задачами были проведены экспериментальные<br />исследования эффекта иммобилизации – изучены возможности ингибирования<br />мутагенного действия канцерогенных азо- и антрахиноновых красителей в<br />прединициационный период – путем их иммобилизации на неспецифических<br />модификаторах (натуральных полимерных матрицах – крахмал, целлюлоза, желатин). <br />В связи с отсутствием в настоящее время разработанных методических и<br />методологических подходов к тестированию пищевых добавок на мутагенность [31,<br />32], учитывая опыт других авторов [229-236] и рекомендации ВОЗ, была выбрана и<br />дополнена схема тестирования (ранее используемая для оценки лекарственных<br />препаратов) [229], состоящая из трех этапов, включающих в себя исследования в<br />системах in vitro и in vivo c использованием четырех тест-объектов<br />(микроорганизмы, культура лимфоцитов человека, насекомые, млекопитающие), в<br />которую были внесены некоторые дополнения. <br />На первом этапе проводили экспериментальные исследования по выявлению<br />мутагенной активности изучаемых веществ, используя экспресс-методы в системе in<br />vitro: учет генных мутаций на гистидин-зависимых штаммах Salmonella typhimurium<br />в тесте Эймса-Salmonella/микросомы млекопитающих и цитогенетические<br />исследования в культуре лимфоцитов человека [220, 237-241]. <br />На втором этапе тестирования исследования проводили в системе in vivo.<br />Осуществляли качественную и количественную оценку мутагенной активности<br />изучаемых пищевых добавок. В опытах на Drosophila melanogaster [242-244]<br />использован метод учета рецессивных, сцепленных с полом летальных мутаций, а<br />также проведена оценка возможности использования метода учета доминантных<br />летальных мутаций (в качестве отборочного) при тестировании пищевых добавок на<br />мутагенность. <br />В исследованиях на млекопитающих использовали методы учета: хромосомных<br />аберраций в клетках костного мозга мышей и доминантных летальных мутаций в<br />зародышевых клетках мышей [245-2509]. <br />На третьем этапе осуществляли анализ полученных экспериментальных данных,<br />определяли уровень мутагенной опасности новых пищевых добавок для человека,<br />делали заключение об изучаемых веществах [229-230]. <br />С целью выявления роли свободнорадикальных процессов в формировании мутагенного<br />эффекта иммобилизованных азо- и антрахиноновых красителей, проводили<br />исследования по оценке сочетанного действия этих красителей с веществами,<br />обладающими антиоксидантными и мембранотропными свойствами. <br />Выбранная схема исследований (с дополненнями), отражена в табл. 2.1.<br />2.2. Материалы исследований <br />2. 2. 1. Т е с т – объекты. Основными тест-системами исследований были:<br />микроорганизмы, насекомые, млекопитающие и культура лимфоцитов периферической<br />крови человека. <br />Для оценки способности изучаемых соединений индуцировать генные мутации в<br />системе in vitro использовали индикаторные штаммы Salmonella typhimurium ТА 100<br />и ТА 98, несущие мутации ауксотрофности по гистидину [237]. Штамм ТА 98,<br />обнаруживает действие соединений, индуцирующих мутации типа “сдвига рамки”, а<br />штамм ТА 100 способен регистрировать мутагенный эффект веществ, вызывающих<br />мутации типа “замены оснований”. <br />Таблица 2.1<br />Схема оценки мутагенности химических соединений<br />Этап<br />Цель <br />этапа<br />Основные методы<br />Показатели<br />Уровень выраженности мутагенного эффекта (в баллах)<br />отсутствие <br />эффекта (0)<br />слабый <br />эффект (1)<br />средний эффект (2)<br />сильный эффект (3)<br />8<br />Выяв-ление мута-генов в систе-ме <br />in vitro<br />1. Тест Эймса – <br />Salmonella/микро-сомы<br />Превышение числа ревертантов в опытах над обычным контролем (кратность)<br />Отсутствие достоверных различий по отношению к обычному контролю<br />Достоверные различия <br />до – 10 <br />>10-100<br />>100<br />2. Учет аберраций хромосом в культу-ре лимфоцитов <br />пе- риферической крови человека<br />Превышение частоты мутаций над спонтанным фоном (разность)<br />Отсутствие достоверных различий<br />Достоверные различия <br />до – 10 <br />>10-25<br />>25<br />Продолжение табл. 2.1<br /><br />7<br />II<br />Оценка мутагенной активности в системе in vivo<br />1. Учет рецессивных летальных мутаций у дрозофилы<br />Превышение частоты мутаций над спонтан- ным фоном (кратность)<br />Отсутствие достоверных различий<br />Достоверные различия <br /> до – 5 <br />>5-10<br />>10<br />2. Учет доминантных летальных мутаций у дрозофилы<br />Процент индуцирован- ной летальности<br />до 10%<br />>10-25<br />>25<br />3.Учет доминантных летальных мутаций у мышей<br />Процент индуцированной летальности<br />до 10%<br />>10-25<br />>25<br />4. Учет аберраций хромосом в клетках костного мозга мышей<br />Превышение частоты мутаций над спонтан- ным фоном (разность)<br />Отсутствие достоверных различий<br />Достоверные различия <br /> до – 10<br />>10-25<br />>25<br />III<br />Анализ и оценка экспериментальных данных, заключение о препарате<br /><br />Для исследования способности иммобилизованных красителей индуцировать<br />повреждения хромосом изучали их цитогенетический эффект в <br />культуре лимфоцитов периферической крови человека. Для культивирования<br />использовали венозную кровь практически здоровых доноров мужского пола в<br />возрасте от 20 до 40 лет, которые не подвергались воздействию потенциальных<br />мутагенов в течение последних 6 месяцев. Кровь для исследований получали на<br />городской станции переливання крови. <br />В исследованиях на Drosophila melanogaster использовали линии дикого типа,<br />характеризующиеся хорошей жизнеспособностью и высокой интенсивностью<br />яйцекладки: Д-32, Canton-S. При постановке метода Меллер-5 использовали<br />тестерную линию (scsi B In S wa sс8). Указанные линии были взяты из коллекции<br />кафедры генетики</p>
- Київ+380960830922