<p>РОЗДІЛ 2<br />МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ<br /> 2.1. Матеріал дослідження<br /> Проведено генетичне обстеження 78 пацієнтів з попереднім клінічним діагнозом одного з ССА, а саме: СВХ - 3 пацієнта, синдром "котячого крику" - 1 пацієнт, СВБ - 21 пацієнт, ССМ - 2 пацієнта, СПВ - 19 пацієнтів, синдром мікроделеції 22q11.2 - 31 пацієнт, синдром "котячого ока" - 1 пацієнт. Крім того обстежено 6 батьків та 4 членів родин пробандів. <br /> Матеріалом дослідження були лімфоцити периферичної крові осіб з різних регіонів України, у яких з 1998 по 2006 рік під час медико-генетичного консультування та/або знаходження на лікуванні було запідозрено ССА. Пацієнти проходили консультування на кафедрі медичної генетики НМАПО імені П.Л. Шупика, у медико-генетичному центрі УДСЛ "ОХМАТДИТ", у медико-генетичному відділенні Інституту педіатрії, акушерства та гінекології АМН України, Дитячої клінічної лікарні №1 та знаходилися на лікуванні у 3-му та 4-му хірургічних відділеннях Інституту серцево-судинної хірургії ім. М.М.Амосова АМНУ, у відділенні новонароджених Науково-практичного медичного центру дитячої кардіології та кардіохірургії МОЗ України. При виявленні структурних перебудов хромосом у пробандів досліджували каріотип їх батьків. Розподіл пацієнтів за віком та статтю наведено у табл. 2.1.1.<br /> Для вирішення поставлених завдань у генетичній лабораторії кафедри медичної генетики НМАПО імені П.Л.Шупика було отримано та проаналізовано препарати хромосом метафазної і прометафазної конденсації 78 пацієнтів з підозрою на ССА та 6 батьків і 4 членів родин. <br /> <br /> <br />Таблиця 2.1.1<br />Розподіл пацієнтів з підозрою на ССА за віком та статтю<br />Попередній<br />клінічний<br />діагноз ВікВсьогоСтать10 дн. -1 міс.1 міс. - 1 р.1 р. - <br />5 р.5 р. -<br />12 р.12 р. і старшеЖін.Чол.Синдром мікроделеції 22q11.2<br />16<br />31<br />16<br />15Синдром Вільямса-Бойрена <br />11<br />21<br />10<br />11Синдром Прадера-Віллі<br />19<br />10<br />9Синдром Вольфа-Хіршхорна<br />1Синдром Сміта-Мадженіса<br />-Синдром "котячого крику"<br />1Синдром "котячого ока"<br />1Підозра на ХП-1---1-1Всього82028166783939 Клінічні характеристики пацієнтів були надані лікарями-генетиками кафедри медичної генетики НМАПО імені П.Л.Шупика, медико-генетичного центру УДСЛ "ОХМАТДИТ", Інституту педіатрії, акушерства та гінекології АМН України, Дитячої клінічної лікарні №1. <br /> Цитогенетичні (виготовлення та аналіз хромосомних препаратів метафазної та прометафазної конденсації) та молекулярно-цитогенетичне дослідження (FISH-аналіз) проводили на базі генетичної лабораторії кафедри медичної генетики НМАПО імені П.Л.Шупика, акредитованої МОЗ України на право проведення вимірювань у сфері охорони здоров'я. Частину молекулярно-цитогенетичних досліджень проводили в межах спільного гранту (№7 IP 62652, 7 IP 051778) на базі Інституту медичної генетики, Цюріх, Швейцарія.<br /> Всі дослідження проводили із використанням атестованого та метрологічно перевіреного обладнання і реактивів якості "чда" та вище.<br /> <br /> 2.2. Методи дослідження<br /> Забір матеріалу (периферична кров з ліктьової вени пацієнтів) у 78 пацієнтів з підозрою на ССА здійснювали у стерильні моновети з гранулами гепарину (Sarsted). Кров культивували у поживному середовищі PВmax виробництва "Gibco", до складу якого входять фітогемаглютинін, ембріональна теляча сироватка, антибіотик.<br /> Культуральну суміш "PВmax" з усіма компонентами для культивування попередньо розливали по пластиковим пробіркам для культивування фірми NUNC та зберігали при t -200 С.<br /> <br /> 2.2.1. Застосування стандартного цитогенетичного аналізу.<br /> Під час стандартного цитогенетичного аналізу були досліджені препарати метафазних пластин лімфоцитів периферичної крові хворих. Препарати були отримані за загальноприйнятою методикою (Hungerford et al., 1965) [21, 152]. <br /> Техніка методу:<br />1. В кожну пластикову пробірку з культуральною сумішшю "PВmax", попередньо нагріту до кімнатної температури, додавали по 0,5 мл крові (по 0,4 мл крові від новонародженої дитини). Обережно перемішували вміст пробірки. На кожного пацієнта готували щонайменше по дві пробірки.<br />2. Поміщали пробірки в термостат (t +37?C) на 72 години.<br />3. На 70-й годині культивування в кожну пробірку додавали по 0,3 мл розчину колхіцину (колцеміду) ("Gibco") (кінцева концентрація 10 мкг/мл). Термін експозиції - 2- 2.5 години. <br />4. Відцентрифуговували пробірки протягом 6 хвилин (1,5 об./хв.).<br />5. Знімали надосадову рідину, збовтували осад за допомогою вортексу та доливали розчин гіпотонії, який був попередньо приготований (для приготування 0,55 М розчину KCl розчиняли 560 мг KCl в 100 мл дистильованої води) та підігрітий до t +37?C.<br />6. Експозицію в гіпотонічному розчині проводили при кімнатній температурі - 15 хвилин.<br />7. Відцентрифуговували пробірки протягом 6 хвилин (1,5 об./хв.).<br />8. Знімали надосадову рідину, збовувтали осад за допомогою вортекса, доливали щойно приготовану фіксуючу суміш (змішували етиловий спирт 96° з крижаною оцтовою кислотою у співвідношенні 3:1).<br />9. Експозиція в фіксуючій суміші при кімнатній температурі - 10 хвилин. <br />10. Відцентрифуговували пробірки протягом 6 хвилин (1,5 об./хв.).<br />11. Знімали надосадову рідину, збовтували осад за допомогою вортекса, доливали фіксуючу суміш.<br />12. Відцентрифуговували пробірки протягом 6 хвилин (1,5 об./хв.).<br />13. Повторювали п.11 до одержання прозорої надосадової рідини. Після цього відцентрифуговували та знімали надосадову рідину.<br />14. Осад збовтували вортексом та розкапували на предметні скельця, які заздалегідь були знежирені, промиті у проточній, потім у дистильованій воді та охолоджені у холодильнику. При розкапуванні предметне скло тримали пінцетом на випростаній руці. Не витираючи скельце, капали пастерівською піпеткою 3-4 крапл</p>
- Київ+380960830922