Ви є тут

Вплив рутину, кверцетину та їх комплексів з алюмінієм на динаміку скорочення скелетного м'язу жаби

Автор: 
Мельничук Ольга Миколаївна
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2006
Артикул:
0406U000832
129 грн
Додати в кошик

Вміст

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Реактиви
В роботі були використані препарати: кверцетин, рутин та хлорид алюмінію
(Sigma-Aldrich CO.P.O.).
Інші реактиви та органічні розчинники кваліфікації х.ч. або ч.д.а.
(“Хімлаборреактив”, Україна).
Для приготування водних розчинів застосовували дистильовану воду.
2.2. Реєстрація динамічних параметрів при скороченні м’язових волокон
Фіксація динамічних параметрів скорочення пучків скелетно-м’язових волокон
представляє методичні труднощі. Однією з основних причин є швидкоплинність
процесів скорочення на фоні електростимулюючого сигналу. Виходячи з цього для
оптимальної фіксації параметрів скорочення в якості досліджуваного об’єкту нами
було обрано м’яз холоднокровної тварини Rana temporaria, який являє собою
переважно повздовжні м’язові волокна з порівняно невеликим латентним періодом
скорочення. Температуру омиваючого розчину підтримували в межах 2-4 С0 для
сповільнення біохімічних реакцій скорочення, що давало можливість фіксувати
вимірювальними приладами коротко-часові зміни в динаміці скоротливого процесу
та одночасно не виводити досліджуваний м’яз за межі фізіологічного
функціонування.
Експеримент проводили в ізотонічному режимі при постійному контролі температури
та дискретній фіксації динамічних параметрів скорочення. В процесі проведення
експерименту фіксували силу скорочення, зміну довжини м’язу, температуру
омиваючого розчину та параметри стимулюючого сигналу при постійному контролі
зовнішнього навантаження.
Досліди проводили в постійно циркулюючому розчині Рінгера з періодом релаксації
2, 3 хвилини. Після використання розчинів флавоноїдів м’яз відмивали
фізіологічним розчином до досягнення вихідних параметрів скорочення. Слід
відмітити, що час відмивання при використанні різних реагентів суттєво
відрізнявся (1-2 хвилини за низьких концентрацій, 30-40 хвилин при високих
концентраціях досліджуваних речовин).
У експериментах використовували розчини флавоноїдів в діапазоні концентрацій
від 10-8 до 10-3 моль/л. Кверцетин розчиняли в 96% етиловому спирті, рутин
розчиняли в диметилсульфоксиді (ДМСО). Перед проведенням кожного досліду з
флавоноїдами, проводили тестування динаміки скорочення м’язу під впливом
розчину з застосованим розчинником. Якщо сам розчинник змінював параметри
скорочення м’язу, це враховували при подальшій обробці результатів і за
контрольний рівень брали динамічні показники скорочення під впливом розчину з
використаним розчинником. Кінцева концентрація розчинників в омиваючому розчині
у всіх дослідах не перевищувала 0,5%.
Всі описані досліди проводили при фіксованій температурі. Підтримання
температури здійснювали за допомогою термостатичного пристрою.
При обробці отриманих результатів визначали зміну сили та довжини скорочення
м’язових волокон впродовж початкової і кінцевої фаз скорочення, а також при
досягненні м’язовими волокнами стаціонарного рівноважного рівня скорочення
(тривалість біну 500 мс). Протягом всього експерименту фіксували час досягнення
динамічними параметрими 50% та 25%-вого рівня від контрольних значень.
2.3. Обладнання
Для реєстрації сили скорочення пучків волокон скелетного м’язу використовували
тензометричну установку, створену на кафедрі біофізики Київського національного
університету імені Тараса Шевченка. Даний пристрій являв собою комплекс, що
складався з: камери з системою датчиків, в якій розміщувався досліджуваний
препарат, системи насосів та дозаторів, датчиків сили та довжини, генератора
синхронних імпульсів, системи термоконтролю, осцилографів, комплексу АЦП-ЦАП,
персонального комп’ютера і системи оптичних пристроїв для візуального
спостереження за експериментом та обслуговування і підготовки препарату для
досліду (рис. 2.1).
Стимуляцію здійснювали електричними імпульсами прямокутної форми тривалістю 2
мс, які формували за допомогою генератора імпульсів, керованим ЦАП, через
платинові електроди. Тривалість стимуляційного сигналу становила 3000 мс.
Електроди нерухомо фіксували безпосередньо в дослідницькій камері паралельно
один від одного на відстані 8 мм. Характеристики стимулюючого сигналу задавали
програмно і передавали з комплексу АЦП-ЦАП на генератор з часом затримки не
більш 0,007 мс. Згенеровані аналогові імпульси поступали через подразнюючі
електроди до дослідницької камери з м’язовим препаратом. Час затримки при цьому
становив не більш 0,08 мс. Загальний час затримки фіксували на вході комплексу
АЦП-ЦАП, що дозволяло компенсувати його при обробці результатів. Криві,
представлені в роботі, будували з врахуванням часової затримки сигналів
входу-виходу перетворювача. Полярність стимуляції можна було змінювати в
залежності від симетричності розміщення подразнюючих електродів відносно
просторового розміщення досліджуваного препарату. Паралельний візуальний
контроль стимулюючого сигналу здійснювали за допомогою катодного осцилографа.
Камера (рис. 2.2) являла собою плексигласову ємність, в якій розміщували
досліджувані пучки волокон скелетного м’язу. Камеру було влаштовано таким
чином, що за допомогою системи насосів забезпечувалась постійна циркуляція
фізіологічного омиваючого розчину Рінгера впродовж всього експерименту, та
швидка зміна розчинів при фіксації об’єму за допомогою дозатора. Це сприяло
подовженню терміну життєздатності препарату та прискорювало відновлення його
нормального фізіологічного стану після стимульованих скорочень. Камера мала два
водовідштовхуючі отвори для лігатур які, в свою чергу, були з’єднані з
датчиками сили та довжини.
Рис. 2.2. Камера з препаратом
Швидкість протікання розчину через до