РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали досліджень
В дослідженні було використано клітинні лінії A431 (епідермоїдна карцинома
вульви людини), HeLa (аденокарцинома шийки матки людини), MCF7 (аденокарцинома
молочної залози людини), А2780 (аденокарцинома яєчника людини), CaОv
(аденокарцинома яєчника людини), CHO (епітеліальні клітини яєчника сірійського
хом’яка); перевивні клітини карциноми Герена; зразки пухлин та
умовно-нормальних тканин ендометрію людини (хірургічний матеріал). Зразки
хірургічного матеріалу було отримано з відділення онкогінекології Інституту
онкології АМНУ, зав. відділенням проф. Воробйова Л.І. (18 зразків пухлин та
умовно-нормальних тканин) та міського онкоцентру м. Дніпропетровська (9 зразків
умовно-нормальних тканин та 32 зразка пухлин). Пацієнти були проінформовані та
дали згоду на використання хірургічного матеріалу в дослідницьких цілях.
Класифікацію пухлин проводили згідно класифікації ВООЗ.
2.2. Культивування бактеріальних та еукаріотичних клітин
2.2.1 Культивування бактеріальних штамів
В роботі було використано клітини E.coli, штам BL21 (DE3). Культивування
проводили в середовищі LB, що містило 10 г NaCl, 5 г дріжджового екстракта та
10 г бактотриптона на 1 л Н20. Селекцію клонів після трансформації та їх
подальше зберігання проводили на агаризованому середовищі LB, що містило 50
мкг/мл канаміцину.
2.2.2. Культивування клітинних ліній
Лінії клітин вирощували при 370С у середовищах DMEM або RPMI-1640, що містили
5-10% сироватки великої рогатої худоби (Gibco BRL, Великобританія), в атмосфері
5% СО2. Для культивування використовували пластикові флакони, та планшети
(Nunc, Данія; Costar, США; Greiner, Німеччина), а також скляні чашки Петрі
(Anumbra, Німеччина).
При дослідженні впливу ЕФР на експресію та ферментативну активність p70S6K
клітини вирощували до 70% моношару, змінювали середовище на безсироваткове, в
яке вносили 25нг/мл ЕФР.
2.3. Біохімічні методи
2.3.1. Електрофорез білків в денатуруючих умовах
Електрофорез білків в денатуруючих умовах з використанням додецилсульфату
натрію проводили за схемою Лемлі [126-114] у поліакриламідних гелях товщиною 1
мм при градієнті концентрації акриламіду 7-22%. Використовували камери для
електрофорезу “Біорух” (Україна). Електрофорез проводили при постійному струмі
(в концентруючому гелі - 20 мА, в розділяючому - 40 мА) з джерелом постійного
струму ПЕФ-3 (СРСР). В якості лідируючого барвника використовували
бромфеноловий синій. Гелі після електрофорезу фарбували 0,15% розчином
діамантового синього Coomassie G250 (Ferak, Німеччина) в суміші вода : етанол :
оцтова кислота (6:3:1). Гелі відмивали розчином в суміші вода : етанол : оцтова
кислота (6:3:1).
2.3.2. Фарбування поліакриламідних гелів сріблом
Для візуалізації білків в поліакриламідних гелях використовували метод Merril
et al. [127]. Всі розчини готували на деіонізованій воді. Гель фіксували у
розчині 50% метанолу, 5% СН3СООН впродовж 20 хв. Після цього гель промивали 50%
метанолом (10 хв.), Н2О (10 хв.), інкубували в 0,02% Na2S2O3 (1 хв.) та двічі
промивали Н2О по (1 хв.). Гель інкубували на льодяній бані в розчині 0,1% AgNO3
(30 хв.) та двічі промивали Н2О по 1 хв. Гель проявляли розчином, що містив 2%
Na2CO3, 0,05% формалін. Реакцію зупиняли 5% СН3СООН.
2.3.3. Електроелюція повнорозмірної рекомбінантної p70S6Kaa з поліакриламідного
гелю
Для виділення повнорозмірної рекомбінантної форми р70S6-кінази було застосовано
метод електроелюції білка з поліакриламідного гелю. Для цього культуру E.coli
BL21 (DE3), трансформовану експресуючим вектором pET23d/Hisp70S6Кaa, вирощували
в середовищі LB, що містило канаміцин в концентрації 50 мкг/мл. При досягненні
культурою логарифмічної фази росту (OD620=1) проводилась індукція клітин шляхом
додаванням IPTG до кінцевої концентрації 1 мкМ. Після індукції продовжували
культивування бактеріальної культури при 37 С з інтенсивним перемішуванням на
протязі 4-год. По закінченні культивування клітини осаджували центрифугуванням
(центрифуга К-26, НДР, 3000 об/хв., 30 хв.), промивали холодним розчином PBS,
ресуспендували в буфері лізису, який містив 10 мМ Трис-HCl pH 8,0; 50 мM NaCl
та інгібітори протеїназ (1 мМ PMSF, 0,2% апротиніну, 5 mM бензамідину), і
руйнували в ультразвуковому дезінтеграторі. Клітинний лізат центрифугували при
13000 g протягом 20 хв. при 4оС. Осад тричі ресуспендували та центифугували в
вищенаведеному буфері. Осад перерозчиняли в лізуючому буфері, що містив 8 М
сечовини, та проводили препаративний електрофорез по Леммлі в градієнті
акриламіда 7-22%. Розподілення білків візуалізували на фрагменті геля за
допомогою барвника Кумассі G-250, після цього з решти гелю вирізали зону, що
відповідала білку з молекулярною масою 70 кДа. Далі смужка гелю переносилась в
діалізний мішок (Millipore, США). Після цього застосовували електроелюцію в
електродному буфері по Леммлі, що містив 8 М сечовини (3 год, сила струму 40
мА). Отриманий зразок діалізували проти буферу PBS (80 mM Na2HPO4, 20 mM
NaH2PO4, 100 mM NaCl), що містив 8 М сечовини і зберігали при –20оС. Для
перевірки чистоти препарату використовували електрофоретичний аналіз з
подальшим фарбуванням гелю нітратом срібла та метод Вестерн-блот аналізу з МКАТ
проти С-кінцевої ділянки p70S6Кaa.
2.3.4. Отримання лізатів клітин і тканин та визначення концентрації білків
Для приготування лізатів використовували буфер RIPA (20 mM Tris pH 7,5, 150 mM
NaCl, 1 µµM ЕДТА, 1 µµМ ЕГТА, 1% Triton X-100) з інгібіторами протеаз та
фосфатаз. Інгібітори: апротинін - 2 мкг/мл, леупептин - 1 мкг/мл, бензамідин -
5µµМ, інгібітор трипсину з сої - 100мкг/мл, Na3VO4 - 1 µµM, NaF - 50 mM. Зразки
гомогенізували
- Київ+380960830922