РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Моделювання експериментального алергічного енцефаломієліту у щурів
В якості демієлінізуючого процесу у щурів був використаний експериментальний
алергічний енцефаломієліт – модельне захворювання центральної нервової системи
з аутоімунним компонентом. Клініка ЕАЕ включає багато неврологічних симптомів,
неврологічний дефіцит та зміни лабораторних показників у тварин подібні до
таких самих змін при розсіяному склерозі у людини [28]. Звичайно, ЕАЕ є
алергічним експериментальним демієлінізуючим процесом, а РС – аутоімунним
захворюванням, отже, ЕАЕ лише почасти відповідає РС [70]. Але відтворення ЕАЕ з
великою сталістю у різних тварин сприяє одержанню суттєвих даних про
морфологічні та імунологічні зміни при демієлінізуючих захворюваннях нервової
системи [27, 35, 37 41, 42, 70]. Такий аутоімунний процес у цілому є
органоспецифічним алергічним захворюванням, при цьому в органі-мішені, тобто
мозку, розвиваються морфологічні зміни, які є характерними для ГУТ [65].
Імунопатологічними механізмами при ГУТ є переважно прояви клітинного імунітету,
розвиток імунологічного запалення, що опосередковано впливом клону
антигенспецифічних Т-лімфоцитів і макрофагами. Імунологічне запалення в
організмі хворої тварини проявляється, окрім системних змін в імунному статусі,
місцевими трофічними розладами в місцях інокуляцій для індукції ЕАЕ, що можна
визначити ad oculus.
Для моделювання ЕАЕ були використані рекомендації Давидової Г.С. (1969), але зі
зміною співвідношення компонентів ЕС, що дозволило отримати гострий, легкий та
хронічний рецидивуючий перебіг ЕАЕ [70]. Легкий перебіг ЕАЕ дозволяє вивчити
вплив факторів на перебіг демієлінізуючого процесу [72], тому що при
моделюванні гострого ЕАЕ, за даними літератури визначається висока летальність
експериментальних тварин [42], до 30-60%.
Розподіл тварин (рис. 2.1) проводився з урахуванням шляхів індукції ЕАЕ та
лікування різними клітинними субстратами нативної та кріоконсервованої
фетальної нервової тканини різних строків вагітності [1]. Вплив на ЕАЕ
будь-яких факторів вивчався на висоті клінічних проявів захворювання, що
збігається з думкою інших дослідників [71, 74-76, 79, 80].
Дослідження було виконано на 147 самках не чистолінійних білих щурів вагою 200
г розводки віварію Інституту нейрохірургії ім. акад. А.П. Ромоданова АМН
України (рис. 2.1). Всі щури перед дослідженням були в карантині 1 місяць. При
дослідженні було сформовано чотирнадцять груп тварин. Для імунізації тварин
використовувалась енцефалітогенна суміш, до складу якої входив або вітчизняний
повний ад’ювант Фрейнда, або американський повний ад’ювант Фрейнда, виробництва
Difco laboratories, Detroit, USA. Чотири групи були імунізовані
енцефалітогенною сумішшю з використанням вітчизняного ад’юванта з більшою
кількістю мікобактерій туберкульозу в 1 мл, аніж в ад’юванті Difco. ЕС за
рекомендаціями Давидової Г.С. (1969) [41, 42] вводилась в подушечки ступнів
задніх кінцівок. Для дослідження особливостей вітчизняного ад’юванту трьом
щурам був введений лише ад’ювант, таким чином була сформована клінічна група
№5. Іще вісім груп тварин було імунізовано енцефалітогенною сумішшю з
використанням ад’юванта Difco. Для дослідження особливостей цього ад’юванту
трьом щурам був введений лише ад’ювант, таким чином була сформована клінічна
група №14. З 12 клінічних груп, у яких енцефаломієліт викликався імунізацією
енцефалітогенною сумішшю, яка складалася з повного ад’юванту Фрейнда та
мозкової тканини, 5 груп були контрольними, іншим на висоті клінічних симптомів
перебігу ЕАЕ було введено елементи ФНТ чи ЕНТ.
Енцефалітогенну суміш одержано змішуванням емульсії мозку дорослих щурів та
повного ад’юванту Фрейнда. Для цього під тіопенталовим наркозом (2% розчин
тіопентала натрію, в розрахунку 0,15 мг/г ваги тварини, з поступовим
титруванням [60] до отримання глибокого наркозу), видаляли спинний мозок, який
піддавали дезагрегації (фрагменти мозку не перевищували 1 мм3) та розміщували в
CMF- буфері (не містить іонів кальцію та магнію). Мозкову емульсію отримували з
мозку дорослих щурів і дистильованої стерильної води розтиранням у порцеляновій
ступці. До мозкової емульсії додавали повний ад’ювант Фрейнда.
Використовувались ад’юванти вітчизняного та американського виробництва – Difco
laboratories, Detroit, USA. Для отримання ЕС (за рекомендаціями [41, 42])
ад’ювант додавався до мозкової емульсії в різній кількості. Співвідношення
ад’юванту Фрейнда – з використанням вітчизняного та американського ад’ювантів –
до мозкової емульсії було 1:1 – ЕС №1 і №2, – та 1,6:1 – з використанням
ад’юванта Difco – ЕС №3 (табл. 2.1).
Таблиця 2.1. Розподіл тварин і умови експерименту.
Клінічна група, №
Кількість тварин
Енцефалітогенна суміш, №
Співвідношення ад’юванту до мозкової емульсії
Кількість мікобактерій туберкульозу на 1 тварину
Кількість мозкової тканини на 1 тварину
12
1:1
8,4±0,1 мг
190±10 мг
12
1:1
8,4±0,1 мг
190±10 мг
12
1:1
8,4±0,1 мг
190±10 мг
1:1
8,4±0,1 мг
190±10 мг
Введено лише ад’ювант
8,4±0,1 мг
12
1:1
1,2±0,05 мг
190±5 мг
12
1:1
1,2±0,05 мг
190±5 мг
12
1,6:1
1,33±0,06 мг
160±10 мг
12
1,6:1
1,33±0,06 мг
160±10 мг
10
12
1,6:1
1,33±0,06 мг
160±10 мг
11
12
1,6:1
1,33±0,06 мг
160±10 мг
12
12
1,6:1
1,33±0,06 мг
160±10 мг
13
12
1,6:1
1,33±0,06 мг
160±10 мг
14
Введено лише ад’ювант
1,33±0,06 мг
Такий підхід дозволив отримати тяжкий перебіг гострого ЕАЕ у щурів, яких
імунізували ЕС №1 зі співвідношенням компонентів 1:1, легкий перебіг ЕАЕ у
щурів, яких і
- Київ+380960830922