Генетичний контроль утворення сахаридної частини ландоміцину А

<p>РОЗДІЛ 2<br /> МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ<br /> 2.1. Штами мікрорганізмів та плазміди<br /> Використані в роботі штами E.coli та актиноміцетів подано в таблиці 2.1. Як вектори для клонування та перенесення ДНК в штами актиноміцетів використали плазміди pKC1132, pKC1218, pOJ260mel, pUWLoriT, pSET152, pIAGO; в E.coli - pUC18/19, pMUN2, pLitmus38 [142]. Характеристика цих векторів і сконструйованих на їхній основі плазмід подана в таблиці 2.2. <br /> Таблиця 2.1<br /> Перелік штамів мікроорганізмів, використаних в роботі<br /> штам характеристика джерело отримання S.cyanogenus S136<br /> продуцент ландоміцину А, дикий тип А.Бехтольд, Фрайбуржський університет, ФРН S. cyanogenus?lanGT2<br /> S.cyanogenus S136<br /> із зруйнованим геном lanGT2 Отримані в ході роботи S.cynogenus?lanGT2lanXlanGT1 S.cyanogenus S136 із зруйнованим геном lanGT2 та інактивованими генами lanX та lanGT1 -//- S.cynogenus?lanXlanGT1 S.cyanogenus S136 з інактивованими генами lanX та lanGT1 <br /> -//- S.cyanogenus?lanGT3 S.cyanogenus S136 із зруйнованим геном lanGT3 <br /> -//- Продовження таблиці 2.1 S.cyanogenus?lanGT4 S.cyanogenus S136 із інактивованим геном lanGT4 <br /> -//- S.cynogenus pOJ?GT3(pKC1218ermGT3-4, pUWLoriTZ4Z5) S.cyanogenus?lanGT3, з комплементованими генами lanGT3, Z2, Z3, lanGT4, Z4 та Z5<br /> <br /> -//- S.cynogenus pOJ?GT3(pKC1218ermEGT3Z2Z3 і pUWLoriTZ4Z5) S.cyanogenus?lanGT3, з комплементованими генами lanGT3, Z2, Z3, Z4 та Z5 та інактивованим геном lanGT4 <br /> -//- S.cynogenus?lanZ2 S.cyanogenus S136 із інактивованим геном lan Z2 <br /> -//- S.cynogenus ?lanGT2 (urdGT2) S.cyanogenus S136<br /> із інактивованим геном lanGT2 та ексресованою плазмідою pSET-urdGT2 <br /> -//- Saccharotrix espaniensis продуцент сахароміцинів дикого типу А.Бехтольд, Фрайбуржський університет, ФРН E. coli DH5? (F-(?80d?(lacZ)M15 recA1 endA1 gyrA96 thi1 deoR (lacZYA-argF)U169) <br /> Life Technologies E.coli ET12567 (pUB307) ET12567 (dam-13::Tn9(Cmr) dcm-6 hsdM), що несе плазміду pUB307 К.П. Сміт, Ін-т біомолекулярних студій, Манчестер E. coli BW103 (pUB307) BW103 (F-(?80d recA1 endA1 gyrA96 deoR (lacZYA-argF)U169), що несе плазміду pUB307 Б.Уілкінз, Університет м.Лестер, Великобританія Таблиця 2.2 Перелік плазмідних ДНК, використаних в роботі<br /> плазміда опис джерело отримання pUC19<br /> 2,69 т.п.н. мультикопійна реплікативна плазміда; містить полілінкер, ген стійкості до ампіциліну (ampr) та аміно-термінальний фрагмент гену lacZ Promega pUC18<br /> 2,69 т.п.н. pUC19, полілінкер якої клоновано в протилежній орієнтації Promega pIAGO<br /> 7,47 т.п.н.<br /> мультикопійна реплікативна плазміда; містить реплікони рIJ101 та pUC, гени стійкості до тіостриптону та карб. і промотор транскрипції ermE Х.Салас, університет м. Ов'єдо, Іспанія pHP45omega,<br /> 4,4т.п.н. мультикопійна реплікативна плазміда; містить реплікон pBluescriptIIKS, гени стійкості до ампіциліну (AmpR) та стрептоміцину/спектиноміцину (aadA) Ж.Л. Пернодет, парижський університет, Франція pMUN2<br /> 2,97 т.п.н.<br /> мультикопійна плазміда; містить полілінкер, реплікони ColEI та f1, ген стійкості до беталактамних антибіотиків (blar) та аміно-термінальний фрагмент гену lacZ А. Бехтольд, Фрайбуржський університетет, ФРН pSET152<br /> 5,5 т.п.н.<br /> кон'югаційна інтегративна плазміда, містить ген стійкості до апраміцину Amr, систему інтеграції фага ?С31 П.Лідлей, Кембріджський університет, Великобританія OJ260mel<br /> 5,5 т.п.н.<br /> нерепліктивна кон'югаційна плазміда, що несе ген стійкості до апраміцину (Amr), гени для продукції меланіну melC1 та melC2, аміно-термінальний фрагмент гену lacZ Ю.Демидчук, Кембріджський університет, Великобританія <br />Продовж. табл. 2.2<br /> Н2-26<br /> 45,2т.п.н. pOJ446[71], яка несе кластер генів біосинтезу ландоміцину А А.Бехтольд, Фрайбуржський університетет, ФРН pLitmus38<br /> 2,8 т.п.н. мультикопійна плазміда; містить полілінкер, реплікони ColEI1, ген стійкості до ампіциліну (Ар) та аміно-термінальний фрагмент гену lacZ<br /> <br /> Promega pKC1218<br /> 5,8 т.п.н.<br /> репліктивна кон'югаційна плазміда, що несе ген стійкості до апраміцину (Amr), реплікони pUC та SCP2, оріджин перенесення RK2 К. Панькевич, НДЛ генетики та селекції при кафедрі генетики та біотехнології ЛНУ ім. І. Франка pKC1132<br /> 3,5 т.п.н.<br /> <br /> нерепліктивна кон'югаційна плазміда, що несе ген стійкості до апраміцину (Amr), оріджин перенесення RK2, аміно-термінальний фрагмент гену lacZ П. Бірман, США<br /> pSET152ermE<br /> 5,5 т.п.н.<br /> pSET152 в EcoRV сайт полілінкера якої клонований EcoRV фрагмент, що містить промотор ermE А. Бехтольд, Фрайбуржський університетет, ФРН pKC1218ermE<br /> 6,8 т.п.н. pKC1218 в HindIII-PstI сайт якої клоновано KpnI-PstI фрагмент, який містить промотор ermE <br /> [153] Продовж. табл. 2.2pUWLoriT<br />7,3 т.п.н.<br /> репліктивна кон'югаційна плазміда для експресії, що несе ген стійкості до тіостриптону (tsr)та беталактамів (bla), реплікони ColE1 та SCP2, оріджин перенесення RK2 1 А. Бехтольд, Фрайбуржський університетет, ФРН pUClanGT3<br /> 4,9 т.п.н.<br /> похідна pUC19, в BamHI-SacI сайти якої клоновано відповідний 2,2 т.п.н. фрагмент, який містить гени lanGT3 та lanZ2 Отримана в ході роботиpUC18-LanGT1-lanX5,3 т.п.н.похідна pUC18, в SacI сайт якої клоновано відповідний 2,6 т.п.н. фрагмент, який містить гени lanGTl і lanX <br /> -//-pIAGOermEGT3Z2Z3<br /> похідна pIAGO, в BamHI-SphI сайти якої клоновано відповідний 4.2 т.п.н. фрагмент lan-кластеру, який містить гени lanGT3, lanZ2 та lanZ3 <br /> -//-pMUN-lanGT2 3,17 т.п.н.похідна pMUN1, в MunI-BamHI сайти якої клоновано відповідний 1.2 т.п.</p>