РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Представлене дослідження проведене на 362 білих лабораторних щурах-самцях різних вікових груп, які були узяті з віварію ЛугДМУ в єдиний сезонний період ( червень 2003 р ). Проведено три серії дослідів відповідно до трьох вікових категорій тварин - статевонезрілих (далі - перша серія, I), статевозрілих (друга серія, ІІ) і щурів інволютивного віку (третя серія, ІІІ). Вік кожної експериментальної тварини визначався двома умовами: кількістю діб від народження та масою. Так, до І серії тварин були віднесені щури у віці 34-35 діб з масою 52±12,03 г; до ІІ - у віці 60-65 діб з масою 136,25±10,11 г; до ІІІ- 18 міс. і масою 310±9,49 г .
У межах кожної вікової серії щури були розподілені на чотири групи по 7 тварин у кожній: групи, що знаходилися під впливом гідрокортизону; групи, що отримували ін?екції бісфосфонату "Зомети" (золедронової кислоти); групи, яким на фоні впливу гідрокортизоном були призначені ін?єкції бісфосфонату "Зомета", а також у І серії існувала група щурів, яким вводили дексаметазон. Кожній піддослідній групі призначалася група контрольних щурів, тотожна за віком та кількістю тварин, що отримували щоденні ін?єкції фізіологічного розчину хлориду натрію і слугували контролем для трьох попередніх груп.
Таблиця 2.1.
Розподіл експериментальних тварин за группами, термінами та серіями.
Вікова серія ГрупаТермін спостереження у добах, кількість щурів 7 15 30 90 30+60 І, ІІ, ІІІ К 7 7 7 7 - І, ІІ, ІІІ Г 7 7 7 7 7 І Д 7 7 7 7 7 І, ІІ, ІІІ З 7 7 7 7 7 І, ІІ, ІІІ ГЗ 7 7 7 7 7
Протягом експерименту тварини перебували у стандартних умовах віварію, які узгоджені з нормами біоетики [47, 108], де знаходилися під динамічним спостереженням та зважувалися перед кожним встановленим строком виведення з експерименту.
Стан підвищеного глюкокортикоїдного фону в організмі експериментальних тварин досягався введенням фармакологічного замінника гормону кори надниркових залоз. Для цієї мети з групи глюкокортикоїдних препаратів був вибраний гідрокортизон, оскільки саме він є повноцінним аналогом ендогенно продукованого, нативного кортизолу, що наближає експериментальну модель до фізіологічних умов. З метою надання порівняльної характеристики для гідрокортизону був обраний також його фармакодинамічний антипод -дексаметазон.
Особливість даного експерименту у тому, що в організмі тварини шляхом призначених ін'єкцій гідрокортизону та дексаметазону створювалася така концентрація глюкокортикоїдів, яка відповідає ендогенному фізіологічному піку секреції цих гормонів вранці або в моменти стресу, а фармакологічне дозування базується на мінімальній дозі, здатній надати терапевтичний ефект і яка призначається в клінічній практиці при хронічних процесах, тобто націлена на тривалу підтримуючу терапію. Така доза для гідрокортизону коливається від 25 до 50 міліграмів [48], проте оскільки в клінічній практиці найчастіше призначається преднізолон, то перехід від лікарської форми гідрокортизону до преднізолонового еквівалента проведено згідно з рекомендацією Європейського симпозіуму по глюкортикоїдній терапії [97], що затвердила "преднізоновий еквівалент": 7,5 міліграмів преднізолону (преднізону) за хімічною активністю відповідає 21 міліграмам гідрокортизону.
Препарат дексаметазону, що був використаний в експерименті - ампульований 0,4% розчин дексаметазону гемісукцінат виробництва KRKA: VO2323 D, Словенія. Доза однієї щоденної ін?єкції дексаметазону - 1,07 мг/кг маси, що відповідає 7,5 міліграмам преднізолону. Така доза дексаметазону вводилася першій віковій серії (статевонезрілим щурам) внутрішньом'язово щодня аж до дев'яностої доби експерименту включно, окрім групи реадаптації, щури якої одержували дексаметазон тільки протягом 30 діб, після чого спостерігалися ще 60 днів.
Гідрокортизону ацетат, у експерименті застосований у вигляді стандартної ампульованої 2,5% суспензії (серія №1720403 виробництва ВАТ "Фармак", м.Київ, реєстраційний номер №UA/3288/01/01), вводився щоденно внутрішньом'язово в дозі 21 мг/кг, причому така доза препарату трактується як низька в відповідних зарубіжних експериментальних працях [88, 152]. Так, щури І серії (статевонезрілі) щоденно отримували ін?екції гідрокортизону протягом протязі 7 діб, після чого були декапітовані; інша група - до 15 доби, і потім на ту ж добу забивалися; наступна група - до 30 дня, після чого були декапітовані на 30 добу. Останні тварини були забиті на 90 добу, проте половина з них одержувала гідрокортизон тільки протягом 30 діб, а потім очікувала забою 60 днів без будь-якого впливу (ці щури склали групу реадаптації), а інша половина отримувала гідрокортизон безперервно до 90 дня. Статевозрілі щури (друга серія) та щури щурів інволютивного віку (третя серія) отримували гідрокортизон за такою ж схемою. Оскільки гідрокортизон та дексаметазон достатньо довго перебувають в організмі в активному стані, впливаючи на гормональну активність надниркових залоз, в експерименті враховували циркадні ритми організму піддослідних тварин [86] і через це ін?єкції гідрокортизону робили в першій половині доби.
Серед сучасного терапевтичного арсеналу бісфосфонатів був обраний ліофілізат золедронової кислоти (брендова назва - бісфосфонат "Зомета") виробництва Novartis Pharma AG, Basel, Switzerland, регістраційний номер в Україні № Р.06.01./03.164, серійний номер 993 931.4-983/20es, який у асептичних умовах дозувався і розчинявся стерильним ізотонічним розчином хлориду натрію перед кожною серією ін'єкцій, після чого вводився внутрішньоочеревинно раз у 30 днів. Рекомендована виробником Novartis Pharma AG середня терапевтична доза для людини - 4 міліграми на ін'єкцію 1 раз на 30 днів, з розрахунку на 70 кг ваги, складає 0,057 мг/1000г.
Доза для щурів для ін?єкції раз у 30 днів = (r Х 0,057)/R = 0,362 мг/1000г,
де r = 3,62 - коефіцієнт видової резистентності щурів; R = 0,57 - коефіцієнт видової резистентності для людин