РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
За період з 1998 по 2005 року проведено клініко-імунологічне обстеження у 86 дітей з апендикулярним перитонітом. Усі хворі були віком від 3-х до 15 років. Вибір даного вікового інтервалу пояснюється наступним:
* при ретроспективному аналізі історій хвороб виявлено, що серед прооперованих із приводу перитоніту діти до 3-х років зустрічались лише в 3,6% випадків;
* даний віковий інтервал припадає між третім (2-3 роки) і п'ятим (15 років) критичними періодами імунобіологічної реактивності, тобто на період відносної стабільності імунологічної резистентності дитячого організму;
* технічною спроможністю проведення еферентної терапії (ПФ, ГБО).
2.1. Загальна характеристика обстежених хворих
Всього обстежено 86 хворих дітей із гострим апендикулярним перитонітом. Серед них 10 дітей з місцевим невідмежованим, 32 з дифузним і 44 з розлитими формами.
Групу порівняння (ГрП) склали 49 дітей. Усі діти були прооперовані з приводу гострого перитоніту апендикулярного генезу. Дітям даної групи призначалась комплексна традиційна терапія. У цій групі показники імунного статусу на 1-у добу після операції вивчено в 10 хворих із місцевим, у 20-ти з дифузним і в 19-ти дітей із розлитим перитонітом. Середній вік склав 9,34±2,95 років. Серед хворих 39,2% дівчинки й 60,8% хлопчики. На 14-ту добу після операції вивчено показники імунного статусу в 20 дітей із дифузним і в 19 дітей із розлитим перитонітом.
Основну групу склали 37 дітей, у комплексному лікуванні яких використано гіпербаричну оксигенацію (10 хворих) - підгрупа А; плазмаферез, ГБО та імунозамісну терапію (15 дітей) - підгрупа В; інтраопераційне ультразвукове опромінення (УЗО) очеревини (12 дітей) - підгрупа С. Вивчався клінічний перебіг, стан системного імунітету та неспецифічної протиінфекційної резистентності в динаміці захворювання та в порівнянні із хворими групи порівняння.
До контрольної групи (КГр) входили 20 дітей, відібраних методом випадкової вибірки, які були прооперовані із приводу планової хірургічної патології: пахвинні та пупкові грижі, гіпертрофічний фімоз. Перед операцією проводилось загально-клінічне обстеження, консультація педіатра. Даних за соматичну патологію виявлено не було. Середній вік дітей 9,9±2,61 роки, з них 40% дівчатка й 60% хлопчики. Таким чином, сформована контрольна група за віковими та статевими параметрами наближується до основної групи та групи порівняння.
2.2. Лабораторні методи дослідження
Клініко-лабораторне обстеження хворих дітей проводили клінічним і імунологічним методами. Матеріалом для дослідження була сироватка крові.
Дослідження функціонального стану системи імунітету
Для характеристики імунного статусу та неспецифічного протиінфекційного захисту дітей груп обстеження, виявлення дефектів та встановлення ступеню порушення в клітинній, гуморальній ланках системного імунітету та в системі факторів і механізмів неспецифічного протиінфекційного захисту організму, використовували наступний комплекс показників:
1) абсолютна та відносна кількість імунокомпетентних клітин у периферійній крові одержана шляхом визначення:
- загальний аналіз крові з лейкоцитарною формулою;
- абсолютна (х109 кл/л) та відносна (%) кількість популяцій Т- та В- лімфоцитів (Т-СD3+, B-СD22+), відносна (%) кількість субпопуляцій Т-лімфоцитів (Т-СD4+ хелперів/індукторів та Т-СD8+ супресорів/цитолітичних лімфоцитів).
2) функціональна активність B-лімфоцитів: за визначенням концентрації сироваткових імуноглобулінів основних класів (Ig M, Ig G, Ig А) та визначення концентрації циркулюючих імунних комплексів;
3) основні характеристики функціональної активності поліморфноядерних лейкоцитів крові в фагоцитарній реакції з визначенням фагоцитарного числа (ФЧ) і фагоцитарної активності (ФА) та бактерицидної активності фагоцитуючих клітин за спонтанним і стимульованим НСТ-тестом за методом Park в модифікації Несторової з визначенням цитохімічного коефіцієнту;
4) характеристика неспецифічної ефекторної системи захисту з урахуванням активності системи комплементу з визначенням його титру;
5) розрахункові параметри: лейкоцитарний індекс інтоксикації, імунорегуляторний індекс, імунологічний коефіцієнт, коефіцієнт активності нейтрофілів - вираховували за формулою.
Загальний аналіз крові проводили за загальноприйнятою методикою з визначенням відсоткового співвідношення імунокомпетентних клітин при підрахунку їх у камері Горяєва.
Лейкоцитарний індекс інтоксикації (ЛІІ) визначався за формулою 2.1:
(2.1)
Індекс імунореактивності (ІІР) - за формулою 2.2:
(2.2)
Визначення основних популяцій та субпопуляцій Т- та В-лімфоцитів проводили в реакції непрямої поверхневої імунофлуоресценції з моноклональними антитілами (фірми "Сорбент-ЛТД", Москва) до поверхневих диференційованих антигенів клітин (CD3+ - маркер, який присутній на мембранах загальної популяції Т-клітин; CD4+ - специфічний маркер Т-хелперів/індукторів; CD8+ - специфічний маркер Т-супресорів/цитолітичних лімфоцитів; CD22+ - ідентифікаційний маркер загальної популяції В-лімфоцитів). Для визначення Т-лімфоцитів та їх субпопуляцій, а також В-лімфоцитів використовували мишачі моноклональні антитіла та FITC-кон'югати вторинних антитіл фірми "ДИА-М" (Росія). Дослідження проводили в декілька етапів:
1. Виділення лімфоцитів на градієнті щільності Фікол-Верографін.
У центрифужну пробірку ємкістю 10 мл вносили 3 мл розчину Фікол-Верографін, на поверхню обережно нашаровували 6 мл крові, попередньо розведеної фізрозчином (1:1). Центрифугували протягом 30 хвилин із прискоренням 300 g при кімнатній температурі. Після центрифугування (перший раз - 45 хв при 1500 g, другий раз - 20 хв при 1500 g, третій та четвертий - 10 хв при 1000 g) негайно збирали з інтерфази лімфоцитарне "кільце", лімфоцити тричі промивали фізрозчином, ресуспензували в 1 мл фізрозчину і підраховували кількість клітин у камері Горяєва.
2. Постановка реакці
- Київ+380960830922