Особливості біохімічних змін та молекулярно-генетичний аналіз в сім'ях з високим ризиком хвороби Гоше

<p>РОЗДІЛ 2 <br /> МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ<br />2.1. Матеріал дослідження <br /> Клінічні характеристики хворих були надані лікарями-генетиками медико-генетичного центру та лікарями-гематологами центру дитячої онкогематології Української дитячої спеціалізованої лікарні "ОХМАТДИТ". Матеріалом для дослідження були зразки периферичної крові осіб трьох груп:<br /> Група пошуку - 100 осіб. Цю групу склали дорослі та діти віком від 4 місяців до 51 року - 61 особа жіночої статі та 39 осіб чоловічої статі (табл. 2.1). Це пацієнти з усіх регіонів України, які були направлені в період з 2000-2006 роки до медико-генетичного центру Української дитячої спеціалізованої лікарні "ОХМАТДИТ" з попереднім діагнозом хвороби Гоше.<br /> Таблиця 2.1 Розподіл осіб з групи пошуку за віком та статтю.<br />Вікова групаn<br />(кількість осіб)СтатьчоловічажіночаДо 1 року11562-5 років207135-12 років35122312-18 років169718-51 рік18612 <br /> В анамнезі у них відзначались такі клінічні симптоми: гепато- або/та спленомегалія, профузні носові кровотечі, анемія, тромбоцитопенія, болі у кістках. Всім особам групи пошуку проводили біохімічне визначення глюкоцереброзидазної активності. При виявленні зниженої ферментативної активності у пацієнта додатково проводили біохімічне дослідження хітотриозидазної активності та молекулярно-генетичний аналіз.<br /> Другу досліджувану групу склали батьки пацієнтів групи пошуку та їх сибси - 132 особи.Середній вік цієї групи склав 32 роки.<br /> Група контролю біохімічних досліджень - 76 осіб. Цю групу склали здорові донори з різних регіонів України (35 чоловіків та 41 жінка віком від 8 до 65 років), які добровільно брали участь у обстеженнях та не були кровними родичами дітей з групи пошуку.<br /> Особам всіх трьох груп проводили біохімічне визначення глюкоцереброзидазної активності.<br /> Біохімічні дослідження (визначення глюкоцереброзидазної та хітотриозидазної активності в плазмі та гомогенаті лейкоцитів периферичної крові) та молекулярно-генетичний аналіз (визначення 3 мажорних мутацій в гені GBA) проводили на базі лабораторії медичної генетики медико-генетичного центру УДСЛ "ОХМАТДИТ". Лабораторія акредитована МОЗ України на право проведення вимірювань у сфері охорони здоров'я (Атестат акредитації лабораторії підтверджено 28 квітня 2006 року).<br /> Всі дослідження проводили з використанням атестованого і метрологічно перевіреного обладнання та реактивів якості "чда" та вище.<br />2.2. Методики дослідження <br />2.2.1. Біохімічні методи<br />2.2.1.1. Виділення лейкоцитів<br /> Лейкоцити для визначення глюкоцереброзидазної активності виділяли за стандартним методом [124]. <br /> Для виділення лейкоцитів отримували 5-8 мл гепаринізованої периферичної крові. Обробку отриманих зразків крові проводили не пізніше, ніж через 24 години після венопункції. Після відстоювання при кімнатній температурі зразків крові, відділяли надосадкову рідину в іншу пробірку та центрифугували при 3000g. Отриману плазму відділяли в іншу чисту пробірку для подальшого визначення хітотриозидазної активності. Потім для покращення агрегації еритроцитів, до цільної крові додавали 3% розчин декстрану (Sigma) в 0,9% розчині хлориду натрію. Після повного осадження еритроцитів надосадкову рідину відбирали в іншу чисту пробірку і центрифугували при 2000 об./хв. протягом 5 хвилин. Для гіпотонічного гемолізу поодиноких еритроцитів, що залишились в пробі, до отриманого осаду лейкоцитів додавали 2 мл дистильованої води і витримували протягом 2 хвилин при кімнатній температурі. Після цього відновлювали фізіологічне середовище додаванням 2 мл 1,7% розчину хлориду натрію. Далі повторювали центрифугування і видалення надосадкової рідини та проводили дворазову відмивку лейкоцитів фізіологічним розчином при умовах, наведених вище. Відмиті лейкоцити ресуспендували у деіонізованій воді.<br /> Руйнування на льоду оболонок клітин проводили шляхом триразової обробки ультразвуковим гомогенізатором SONOPULS (Bandelin). <br />2.2.1.2. Визначення кількості білка<br /> Кількість білка в гомогенаті лейкоцитів визначали за методом Лоурі [125]. Для визначення концентрації білка гомогенат лейкоцитів периферичної крові розводили дистильованою водою в 40 разів. Готували свіжий робочий розчин такого складу: 50 мл 2% Na2CO3 в 0,1М NaОН та 1 мл 0,5% CuSO4 в 1% лимоннокислому натрію. До 1 мл розведених лейкоцитів додавали 5 мл робочого розчину та ретельно перемішували зразки. Витримували при кімнатній температурі протягом 10 хвилин, після чого, при постійному змішуванні, додавали 0,5 мл реактиву Фоліна-Чікольтеу. Інкубували проби при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Оптичну щільність визначали за допомогою спектрофотометра Specord - 40 (Analytik Jena AG) при довжині хвилі 500нм. Використовуючи стандартний розчин бичачого сироваткового альбуміну з концентрацією 5, 10, 15, 20 та 50 мкг/мл, будували калібрувальний графік. В реакцію брали кількість гомогенату лейкоцитів, яка відповідала 30 мкг білка.<br />2.2.1.3. Визначення глюкоцереброзидазної активності<br /> Глюкоцереброзидазну активність в гомогенаті лейкоцитів визначали з використанням флюорогенного субстрату 4-метилумбелліферил (МУФ)-?-D-глюкопіранозиду (MU-?-Glc; MW 338.3; SIGMA) за методом [92, 126, 127].<br /> Реакційний буфер: 0,2М цитрат-фосфатний з рН 5,4, який містив 0,5% таурохолата натрію та 0,4% тритону X- 100. <br /> Розчин субстрату: 5 мМ 4-МУФ-?-D-глюкопіранозид в реакційному буфері. <br /> Реакційна суміш містила такі компоненти: 20 мкл розчину субстрату в реакційному буфері та 20 мкл гомогенату лейкоцитів з розрахунку на 30 мкг білка.<br /> Інкубацію проводили протягом однієї години при 37?С. Реакцію зупиняли додаванням 0,6 мл 0,2 М гліцин/NaOH-буферу, рН 10,6. В якості стандартного розчину використовували 500мкМ 4-метилумбелліферон (Sigma). Флюоресценцію звільненого 4-метилумбелліферону вимірювали на багатофункціональному аналізаторі Victor (Wallac Oy) при довжині хвилі збудження 365 нм та емісії 448 нм. Специфічну активність фермента виражали як 1 н</p>