РОЗДІЛ 2
ПРЕДМЕТИ, МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Предмети та матеріали дослідження
Предметами досліджень були: зародки пшениці за ТУ У 24488673.006-2000 "Пластівці із зародків пшениці - біологічно активна добавка" [110], знежирені зародки пшениці за ТУ У 24488673.009-99 "Клітковина харчова - біологічно активна добавка" [111], модельні харчові системи з цієї сировини, термоформовані гарніри на основі ЗЗП, супи з використанням термоформованих гарнірів.
У якості матеріалів досліджень були: крупа рисова за ГОСТ 6292-93 [112], крохмаль рисовий за ГОСТ 7698 [113], концентрат еламіну сухий за ТУ У 00382119-02-99 [114], лист стевії сухий за ТУ У 551/46.16331590.001-97 [115], порошок пектинвміщуючий за ТУ У 23369920.001-97 [116], екстракти (композиції з рослинної сировини) на етанол-гліцериновій основі за ТУ У 13723579.001-94 [117], напівфабрикат кістковий харчовий за ТУ У 40-01566330.073-99 [118]; кальцій хлористий за ГОСТ 4161-77 ?119?; альгінат натрію за сертифікатом фірми виробника ?120] а також:
- оклейстеризовані крохмальні дисперсії на основі рисового крохмалю та екструдованого рисового крохмалю, отримані шляхом гідротермообробки 10% крохмальних суспензій за температури 85...95°С;
- рецептурні композиції на основі знежирених зародків пшениці та термоформовані гарніри на їх основі;
- кулінарна продукція з використанням ТФГ "Екодонор".
Для виробництва екструдатів використовували двошнековий екструдер марки КПА-60 з наступними технічними характеристиками: температура в останній зоні екструдера 60...180°С, частота обертання шнека 7,5 с-1, тиск 20 МПа, діаметр отвору матриці 7,0 мм.
Експериментальна частина роботи проводилась у дослідницьких лабораторіях кафедри технології харчування, кафедри гігієни харчування і мікробіології ХДУХТ, інституті кріобіології та кріомедицини НАН України, спеціалізованому цеху ТОВ "Наша Марка", ПП "Харчпроект" (м. Харків).
2.2. Методи дослідження
Відбір проб для досліджень проводили відповідно до ГОСТ 26929-98 [121], ГОСТ 26312-84 [122], ГОСТ 15113.0-77 [123].
Масову частку вологи або сухих речовин визначали за ГОСТ 15113.4-77 [124], ГОСТ 5900-73 [125].
Вміст білка в сировині та екструдатах визначали за методом Лоурі в модифікації Міллера [126], вміст білка у фракціях - мікрометодом Кьєльдаля [127, 128].
Фракціювання білків проводили методом послідовної екстракції протягом 12 год за співвідношення субстрат:екстрагент - 1:100 за об'ємом (рис. 2.1). Центрифугуванням розділяли розчин I від осаду I. До розчину I додавали сірчанокислий амоній до повного насичення. Осад білків розчиняли в дистильованій воді і діалізували проти дистильованої води з pH 5,0 протягом двох діб за 3...5°С. Осад II глобулінів декілька разів промивали дистильованою водою й висушували ліофільно. Розчин II знову насичували сірчанокислим амонієм. Отриманий осад III альбумінів відділяли і розчиняли в мінімальному об'ємі дистильованої води, діалізували проти дистильованої води й остаточно знесолювали, пропускаючи через колонку з сефадексом G-25. Із осаду I екстракцією 70% C2H5OH отримували препарат проламінів. Із осаду IV екстракцією 0,2% розчином NaOH отримували препарат глютелінів.
Молекулярні маси білкових речовин в отриманих фракціях визначали методом гель-хроматографії [129, 130]. Гель-хроматографію здійснювали на колонці довжиною 400 мм з внутрішнім діаметром 16 мм, заповненій полівініловим гелем TSK - GEL TOYOPEARL HW-60-F (TOYOSODA Japan), що дозволяє розділити поліпептиди в діапазоні 5000...1000000 Да та TSK-GEL TOYOPEARL HW-40-F, що дозволяє розділити поліпептиди в діапазоні 100...10000 Да.
Елюацію проводили зі швидкістю потоку 1,6...1,7 мл/хв буфером наступного складу: Na2HPO4 або Na2H2PO4 30 ммоль/л, NaCl 100 ммоль/л, pH=7,4 ?131].
Рис. 2.1. Схема виділення та фракціювання розчинних білків ЗП та ЗЗП
Зразок у колонку вводився петлевим інжектором кількістю 100 мкл. Вихідні із колонки фракції реєструвались ультрафіолетовим оптичним монітором LKB 2238 Uvicord SII за довжини хвилі для колонки HW-60-F - 280 нм, а для колонки HW-40-F - 254 нм.
Колонки калібрували стандартними речовинами з молекулярними масами. Для колонки HW-60-F: цитохром С (12400), бичачий сироватковий альбумін (66000), карбоангідраза (29000), алкогольдегідрогеназа (150000), ?-амілаза (200000). Для колонки HW-40-F: цитохром С (12400), інсулін (6000), глюкогон (3500), ангіотензин І (1297), вітамін В12 (1357), вітамін В2 (366).
Мертвий об'єм (V0) колонки визначали за об'ємом (V) утримування декстрану блакитного (200000 Да).
Молекулярні маси (М.м.) досліджуваних фракцій визначали за калібрувальним графіком (додаток А.1), що побудований за відношенням об'єму утримування (Vе, мм) до V0 стандартних речовин (вісь X) та lg М.м. (вісь Y). Vе визначали після 3...4 вимірів, помножуючи час утримування (RT,Ч60 с) на усереднену швидкість потоку. Кількісне співвідношення окремих фракцій розраховували за площами піків методом внутрішньої нормалізації.
Для електрофоретичних досліджень білкових фракцій до 100 мкл зразків проб додавали 100 мкл буфера наступного складу: tris/HCl 0,15 моль, 2% DCNa (ДСН) і бромфеноловий синій 0,01%. Після прогрівання (t=100°С, ?=4...5Ч60 с) зразки охолоджували і центрифугували. Зразки піддавали електрофорезу за методом [129]. Для визначення М.м. білків у досліджуваних зразках паралельно проводили електрофорез суміші стандартних білків фірми Sigma USA: цитохрому С, бичачого сироваткового альбуміну, карбоангідрази, алкогольдегідрогенази, ?-амілази. М.м. визначали за калібрувальним графіком (додаток А.1) фактора розподілення Rf від lg М.м.
Поділ і кількісне визначення амінокислот проводили після кислотного гідролізу [132] методом висхідної тонкошарової хроматографії на селікаг