РОЗДІЛ 2 МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ
Для дослідження пластичності ГАМК-ергічної синаптичної передачі в культурі нейронів гіпокампа ми використовували наступні методичні підходи:
1. Приготування первинної культури дисоційованих нейронів гіпокампа низької щільності;
2. методика фіксації потенціалу в конфігурації "ціла клітина";
3. методика парної реєстрації мембранних потенціалів і постсинаптичних струмів;
4. методика позаклітинної електричної стимуляції аксона нейрона;
5. методика локальної позаклітинної суперфузії для аплікації фармакологічних речовин;
6. методика імуноцитохімічного аналізу;
7. методика ЗТ ПЛР;
8. статистична обробка отриманих результатів за допомогою стандартних методів аналізу.
2.1 Отримання первинної культури дисоційованих нейронів гіпокампа низької щільності
Для отримання культури нейронів гіпокампа низької щільності використовувалась відома методика культивування нервових клітин [135]. Новонароджених щурів лінії Вістар декапітували, головний мозок вміщували в мінімальне середовище Ігла ("Sigma", США) с додаванням 20 ммоль/л буфера HEPES, 25 од/мл натрієвої солі бензилпеніциліну та 25 мкг/мл стрептоміцину сульфату. За допомогою скальпеля гіпокамп відокремлювали від решти відділів мозку і розрізали у поперечному напрямку на частини 1 ? 2 мм завтовшки. Ферментативну обробку здійснювали 0,05%-м розчином трипсину (тип XII-S, "Sigma", США) при кімнатній температурі (23 ? 25?С) протягом 5-6 хвилин. Потім тканину промивали чотири рази розчином для культивування, до складу якого входили: мінімальне середовище Ігла ("Sigma", США), 10% кінської сироватки, 6 мкг/мл інсуліну, 2,3 мг/мл бікарбонатного буферу NaHCO3, 25 од/мл натрієвої солі бензилпеніциліну та 25 мкг/мл стрептоміцину сульфату. Суспензію клітин отримували за допомогою механічної дисоціації набором пастерівських піпеток з діаметрами кінчиків, які послідовно зменшувались. Кількість клітин в одиниці об'єму вихідної суспензії підраховувалась за допомогою камери Горяєва. Шляхом додавання розчину для культивування кількість клітин в одиниці об'єму кінцевої суспензії доводилось до такого рівня, при якому щільність клітин при висіванні становила 30000 од/см2.
Клітини висаджували на чашку Петрі, яка була попередньо оброблена полі-L-орнітином ("Sigma", США). В скляне кільце діаметром 9 мм, яке обмежувало площину посадки, наливалось 250 мкл суспензії. Чашки Петрі з суспензією вміщувались в інкубатор ("Jouan", Франція) з контрольованим вмістом двоокису вуглецю (5 ? 0,5% СО2) в повітряно-газовій суміші, контрольованим температурним режимом (37 ? 0,5?С) та постійним пасивним зволоженням. На третій день культивування для пригнічення проліферації гліальних клітин в середовище додавали цитозин-?-D-арабіно-фуранозид (5 мкмоль/л). Режим обробки культури цитозин-?-D-арабіно-фуранозидом підбирався таким чином, щоб пригнітити проліферацію гліальних клітин на такій стадії, коли кількість астроцитів була достатньою для утворення гліального моношару. Повторна повна заміна розчину для культивування проводилась через 20 ? 24 години.
Електрофізіологічні експерименти проводились на нейронах, культивованих протягом 18 ? 28 днів, при кімнатній температурі
(20 ? 23?С). На цей час клітини формували необхідну для досліджень кількість синаптичних контактів, також можна було чітко ідентифікувати морфологічні типи клітин.
Безпосередньо перед експериментом, у два етапи, здійснювали повну зміну розчину для культивування на позаклітинний розчин для електрофізіологічної реєстрації.
2.2 Методика фіксації потенціалу в конфігурації "ціла клітина"
Для вимірювання трансмембранних струмів, які відводились від культивованих нейронів гіпокампа, було застосовано метод фіксації потенціалу на обмеженій ділянці клітинної мембрани ("patch-clamp"), який було описано Неєром та Сакманом [136-138]. Основна ідея полягає у використанні підсилювача електричних сигналів з низьким рівнем шуму у схемі зі зворотним зв'язком, що дає змогу контролювати мембранний потенціал з одночасною безпосередньою реєстрацією трансмембранного іонного струму. За допомогою цього метода можна досліджувати струми (а при деякій модифікації методики - й потенціали) в рамках класичних електрофізіологічних підходів, реєструвати струми амплітудою порядку пікоампер, вивчати вплив фармакологічних препаратів на мембранні структури.
Експериментальна установка для реєстрації іонних струмів була зібрана на базі інвертованого мікроскопа Axiovert 200 ("Carl Zeiss", Німеччина). Використання фазово-контрасного об'єктива (LD Achroplan 40x NA 0.6) дозволяло отримати в системі 400-кратне оптичне збільшення. Розмір клітин, які відбирались для дослідження, складав приблизно 15 ? 35 мкм.
В роботі використовувався підсилювач електричних сигналів Axopatch-200В ("Axon Instruments", США), який давав можливість вимірювати як трансмембранні струми в режимі фіксації потенціалу, так і мембранні потенціали в режимі фіксації струму.
Режим фіксації потенціалу використовувався для реєстрації потенціал-керованих калієвих струмів. В залежності від конкретної мети і від типів струмів, які необхідно було ізолювати, застосовували різні протоколи підтримання мембранного потенціалу і активації іонних каналів. Величина підтриманого потенціалу коливалась в межах -110 ? +60 мВ.
Режим фіксації струму використовувався для дослідження специфіки викликаної електричної активності інтернейронів. В цьому режимі визначався також потенціал спокою досліджуваних клітин і належність їх до певних підтипів нейронів за здатністю генерувати ПД. Для всіх досліджень обирались клітини, потенціал спокою яких був не нижче -40 мВ.
При використанні режиму фіксації струму досліджуваний нейрон гіперполяризувався приблизно до -70 мВ з метою запобігання інактивації різних потенціал-керованих каналів. Після цього на клітину подавались деполяризуючі поштовхи струму тривалістю 500 мс з інкрементом 10 ? 25 пА. При досягненні мінімального надпорогового потенціалу на мембрані клітини виникав поодинокий ПД, параметри яко
- Київ+380960830922