РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Об’єкт і предмет дослідження
Дослідження проведено в експерименті на 122 здорових безпородних білих
щурах-самцях різних вікових груп: дорепродуктивний період (статевонезрілі) – 1
місяць (40 щурів), репродуктивний період (статевозрілі) – 6 місяців (42 щури):
пострепродуктивний період – 18 місяців (40 щурів).
Тварин утримували у віварії Ужгородського національного університету. Годування
проводилось відповідно з нормами інституту харчування АМН України, призначених
для даного виду тварин (Наказ МОЗ СРСР №1179 від 10 жовтня 1983 р. – “Об
утверждении нормативов затрат кормов для лабораторних животных в учреждениях
здравоохранения”).
Догляд за тваринами та всі маніпуляції проводили у відповідності з положенням
„Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для
експериментальних та інших наукових цілей” (Страсбург, 1986 р.), а також у
відповідності до положень „Загальних етичних принципів експериментів на
тваринах”, ухвалених Першим національним конгресом з біоетики (Київ, 2001 р.)
та вимог Додатку до “Правил проведення робіт з використанням експериментальних
тварин”, затверджених наказом Міністрерства охорони здоров’я №755 від 12 серпня
1977 р. “Про заходи щодо подальшого удосконалення організаційних форм роботи з
використанням експериментальних тварин”. Комісією з питань біоетики медичного
факультету Ужгородського національного університету (протокол №1 від 20 січня
2007 р.) порушень морально-етичних норм при проведенні науково-дослідної роботи
на експериментальних тваринах не виявлено.
Для досліджень як експериментальну модель використовували білих щурів,
внутрішні органи яких та органи імунної системи за структурою принципово не
відрізняються від будови органів людини [108, 111, 273].
Об’єктом дослідження були селезінки безпородних білих щурів-самців різного
віку. Досліджено три групи тварин. Перша група – інтактні тварини (норма):
дорепродуктивного віку (11), репродуктивного віку (10) та пострепродуктивного
віку (10) безпородні білі щури-самці. Друга група – експериментальні тварини,
яким вводили антиген – “Імуноглобулін людини нормальний” в дозі 0,02 мг
імуноглобуліна із розрахунку на 100 г маси тварин в 0,2 мл ізотонічного розчину
хлориду натрія в асептичних умовах підшкірно в тил стопи правої задньої
кінцівки щурів. Це оптимальна доза антигена здатна викликати імунну відповідь,
вибрана шляхом підбору доз і враховуючи дані літератури [64, 97]. Третя група –
контрольні тварини, яким замість антигена вводили в ту саму ділянку ізотонічний
розчин хлориду натрія в еквівалентих до імуноглобуліна об’ємах. У кожній
віковій групі і серії щурів було по 5 тварин (табл. 2.1).
Контрольній групі тварин замість антигена вводили ізотонічний розчин хлориду
натрія в еквівалентих до імуноглобуліна об’ємах аби переконатися в тому, що
сама процедура підшкірного введення антигена експериментальним тваринам не
викликає морфологічних змін у лімфоїдних структурах селезінки білих щурів.
Для гістологічного дослідження брали шматочки селезінки із різних відділів
органу, бо паренхіма селезінки має дифузну будову без певної локалізації
лімфоїдних структур.
Антигеном обрано “Імуноглобулін людини нормальний” виготовлений ЗАТ „Трудовий
колектив Київського підприємства по виробництву бактерійних препаратів
„Біофарма”. Діючою основою препарату є імуноглобуліни, що містять антитіла
різної специфічності, концентрація яких у крові при введенні імуноглобуліну
досягає максимуму через 24 години. Препарат є універсальним стимулятором
імунних реакцій в організмі, здатним активізувати імунокомпетентні клітини
[53].
Таблиця 2.1
Розподіл експериментальних тварин – білих щурів-самців на групи
Вік тварин
Характеристика груп тварин, час забору для дослідження селезінки після введення
“Імуноглобуліну людини нормального”
Кількість тварин
Дорепродуктивний вік (статевонезрілі)
Інтактні тварини (норма)
Через 1 добу
Через 3 доби
Через 7 діб
Через 14 діб
Через 1 місяць
Контрольні тварини
10
Репродуктивний вік (статевозрілі
Інтактні тварини (норма)
Через 1 добу
Через 3 доби
Через 7 діб
Через 14 діб
Через 1 місяць
Контрольні тварини
11
Пострепродуктивний вік
Інтактні тварини (норма)
Через 1 добу
Через 3 доби
Через 7 діб
Через 14 діб
Через 1 місяць
Контрольні тварини
10
Всього
122
Експеримент провелено в літньо-осінній період року.
Враховуючи добові коливання кількісних параметрів лімфоїдних органів [24],
забір селезінки проводили з 13 до 14 години відразу після декапітації тварин
при знечуленні. Визначали масу органа. Для гістологічного дослідження шматочки
селезінки фіксували у 10 % нейтральному формаліні.
Селезінку забирали у всіх 31 інтактних щурів, а також у тварин після
одноразового введення антигену чи ізотонічного розчину хлориду натрія через 1,
3, 7, 14 і 30 діб. Такі строки забору матеріалу обрано нами згідно рекомендацій
літератури [32, 51, 112, 135, 149], у які відзначаються найбільш помітні зміни
морфологічних параметрів в лімфоїдних органах після введення антигена.
На гістологічних препаратах, забарвлених гематоксилін-еозином та азур-ІІ
еозином, ми вивчали відносну площу структурних компонентів білої пульпи
селезінки: лімфоїдних періартеріальних піхв та лімфоїдних вузликів, які мають
чотири зони: періартеріальну, мантійну, крайову, а також світлий (реактивний
або гермінативний) центр, а також щільність малих, середніх і великих
лімфоцитів, плазмоцитів та макрофагів.
2.2. Методи дослідження
Фіксація і заливка зразків селезінки у парафінові блоки
Матеріал для морфологічного дослідження забирали відразу після евтаназії
твар
- Київ+380960830922