РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ
(ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ)
2.1. Растительный материал
Плющ обыкновенный Hedera helix собран в окрестностях городов Львова, Кишинева, Гамбурга и в Альпах. Плющ крымский Hedera taurica - на Южном Берегу Крыма и в предгорных районах Крыма, плющ кавказский Hedera caucasigena - в окрестностях г. Тбилиси, плющ колхидский Hedera colchica - в окрестностях г. Тбилиси и из мест интродукции на Южном Берегу Крыма и г. Симферополя, плющ канарский Hedera canariensis - из Марокко, Ливана и ботанических садов г. Донецка (Ботанический сад НАН Украины) и Санкт-Петербурга (Ботанический сад Ботанического института им. Комарова РАН), плющ шотландский Hedera scotica - из Ботанического сада Ботанического института им. Комарова РАН, плющ Пастухова Hedera pastuchovii - из Главного Ботанического Сада РАН (г. Москва).
Кроме видов рода плющ из ботанических садов получены: Aralia armata, Arthrophyllum diversifolium, Botryopanax paniculatus, Brassaia actinophylla, Cussonia paniculata, C. spicata, Delarbrea lauterbachii, Fatsia japonica, Neopanax colensoi, Oreopanax capitatus, Polyscis balfouriana, Polyscias filicifolia Polyscias fruticosa var. plumata, Pseudopanax crassifolius, Pseudopanax crassifolius var. trifoliatus, Schefflera arboricola, Sch. incisa, Sch. petelotii, Sch. trungii, Sch. venulosa, Scheffleropsis angkae, Tetrapanax papyriferum, Trevesia burckii, T. spherocarpa, Tupidanthus calyptratus (из Ботаничекого сада Ботанического института им. Комарова РАН, г. Санкт-Петербург); Dizygotheca elegantissima, Polyscias fruticosa, P. quilfoilei (из Главного Ботанического Сада РАН, г. Москва); Acanthopanax divaricatus, A. sessiliflorus, A. sieboldianus, Eleutherococcus senticosus, Pseudopanax crassifolius (из Ботанического сада Национального университета им. Тараса Шевченко, г. Киев); Tetrapanax papyriferum (из Донецкого ботанического сада НАН Украины); Aralia caschimirica, A. cordata, A. elata var. canescens, A. spinosa, Eleutherococcus henrii, E. senticosus, E. setchuensis, Kalopanax septemlobus var. typicum, K. septemlobus var. maximiwiczii (Государственного Никитского ботанического сада, г. Ялта).
2.2. Приборы и методики физико-химических методов анализа
ЯМР-спектры получены на приборах "Bruker" WM-250, "Varian" VXR-300, "Bruker" AM-300, "Bruker" AM-400, "Bruker" DRX-500. Для двумерных экспериментов использовались стандартные методики COSY-DQF, COSY+RCT, COSY+2RCT, TOCSY, NOESY, ROESY, HSQC, HMBC (пакет стандартных программ фирмы "Bruker"). Время смешивания (спин-локинга) в двумерных экспериментах ROESY составляло 200 мс. Для ЯМР-исследования гликозиды предварительно подвергали троекратной обработке дейтерометанолом или смесью дейтерометанола и тяжелой воды (4:1) каждый раз в течение суток с последующей отгонкой растворителей досуха. Использовали растворы гликозидов в пиридине-d5 или их полных ацетатов в дейтерохлороформе с добавлением внутреннего эталона - тетраметилсилана.
Инфракрасные спектры поглощения получены на приборе "Specord 75 IR" в матрице с бромидом калия, спектры поглощения в видимой и ультрафиолетовой области - на приборе "Specord UV VIS". Масс-спектры с химической ионизацией (газ-реагент аммиак) получены на приборе Varian MAT-44S.
2.3. Хроматографические методики
ТСХ-анализ и контроль разделения гликозидов выполняли на пластинках "Silufol" (Чехословакия). Детектирование пятен тритерпеновых гликозидов и их агликонов на хроматограммах осуществляли 10%-ным спиртовым раствором фосфорновольфрамовой кислоты, 10%-ным спиртовым раствором фосфорновольфрамовой кислоты с добавлением 2% п-оксибензальдегида, в отдельных случаях - 5%-ным спиртовым раствором ванилина с добавлением 0.5% серной кислоты с последующим нагреванием хроматограмм при 100-120оС. Детектирование сахаров проводили 10%-ным спиртовым раствором кислого фталата анилина с последующим нагреванием хроматограмм при 100-150оС.
Двумерный ТСХ-анализ экстрактов и отдельных фракций проводился на пластинках "Silufol" , "Sorbosil" , "Polygram" и "Merck" при использовании в направлении "1" нейтральной хроматографической системы растворителей, а в перпендикулярном направлении "2" - кислой или щелочной системы растворителей. В качестве нейтральной системы использовали смесь хлороформ-метанол-вода (100:30:5 для гликозидов с 1 - 4 сахарными остатками и 100:40:7 для гликозидов с 4-6 сахарными остатками); в качестве кислой - хлороформ-метанол-вода (100:30:5 или 100:40:7 с добавлением 3-5% муравьиной кислоты непосредственно перед хроматографированием), и щелочной - хлороформ-метанол-25%-ный водный аммиак (100:30:6 или 100:40:10).
Препаративное разделение проводили на колонках с силикагелем L (40-100 мкм) или с микросферическим силикагелем "Silpearl" (Чехословакия). Окончательную очистку гликозидов проводили на силикагеле "Silpearl". Использовали следующие системы растворителей: хлороформ-бензол (7:3);. бензол-ацетон (4:1);.хлороформ-метанол-10% водный аммиак (100:50:15), (100:40:10) и (100:30:5);. хлороформ-метанол-вода (100:40:7) и (100:30:5);. хлороформ-этанол (10:1?1:1), насыщенный водой;. хлороформ-этанол (10:1?1:1), насыщенный 10% водным аммиаком.
2.4. Общие химические и биохимические методики
Полный кислотный гидролиз осуществляли путем добавления к 1 мг гликозида 0,1 мл диоксана и 0,1 мл 2 н. водного раствора трифторуксусной кислоты и нагревания 2 ч. при 100оС. Агликон извлекали 0,5 мл бензола и полученный экстракт анализировали ТСХ в системе бензол-ацетон (4:1) или хлороформ-метанол-25% водный аммиак (100:20:1) с заведомыми образцами агликонов. Сахара в гидролизате идентифицировали ТСХ в системах хлороформ-метанол-аммиак (100:40:10) с заведомыми образцами рамнозы, арабинозы, глюкозы, галактозы, ксилозы, глюкуроновой кислоты и других моносахаридов.
Частичный кислотный гидролиз осуществляли путем добавления к 1 мг гликозида 0,1 мл диоксана, 0,1 мл 2 н. водного раствора трифторуксусной кислоты и нагревания 15-20 мин. при 100оС. Прогенины извлекали
- Київ+380960830922