РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
В даній роботі в ході комплексного обстеження поряд з загальноприйнятими клінічними методами визначався рівень плацентарних гормонів в сироватці крові (плацентарний лактоген, естріол), вивчались показники системи гемостазу, проводилось доплерометричне обстеження. Для вивчення плаценти і тромбоцитів проводились спеціальні морфологічні дослідження з використанням електронної мікроскопії на базі ЦНДЛ НМУ ім.акад. О.О.Богомольця.
Матеріалом для лабораторних досліджень була венозна кров вагітних і породіль. Кров отримували методом пункції ліктьової вени і стабілізували 3,8% р-ном цитрату натрію у співвідношенні 1:9. Для отримання цитратної плазми кров центрифугували 10хв при 1500 об/хв.
Досліджувались наступні показники: час згортання крові по Лі-Уайту, активований час рекальцифікації, протромбіновий індекс, фібриноген, продукти деградації фібрину (ПДФ) з використанням етанолового і ?-нафтолового тестів, гемоглобін, гематокритна величина, кількість тромбоцитів, загальний білок крові, сечовина, азот сечовини.
Час згортання цільної крові визначався по методу Лі-Уайта. Принцип його полягає у визначенні часу спонтанного згортання венозної крові. У здорових воно складає 5-10хв.
Активований час рекальцифікації плазми визначався по методу Хауел. В його основі-визначення часу згортання плазми при додаванні до неї оптимальної кількості хлористого кальцію. Нормальні показники-в межах від 50 до 70 сек.
Активність факторів протромбінового комплексу проводилась шляхом визначення протромбінового індексу по методу Квіка в модифікації Кудряшова Б.А. Принцип методу - визначення часу утворення згортка плазми крові при додаванні до плазми надлишку тромбопластину і оптимальної кількості кальцію. При цьому час зсідання плазми характеризує активність протромбіну і прискорювачів його перетворення-факторів протромбінового комплексу (V,VII i X) і гепариноподібних речовин.
ПТІ розраховується за формулою: А/В·100??, де А-час згортання нормальної плазми, В-час згортання досліджуваної плазми. Протромбінова активність крові здорової людини дорівнює 95-105%.
Концентрація фібриногену визначається по методу А.А.Рутберг. В його основі-еквівалентність утвореного фібрину кількості фібрину в плазмі. В нормі в 100мл плазми міститься 200-400мг фібриногену.
Визначення фібриногену В. Фібриноген В (патологічний фібриноген)-це повні і неповні фібрин-мономери, які частково з`єднані з ранніми і пізніми продуктами деградації фібрину (продуктами фібринолізу).
?-нафтоловий тест в плазмі визначався по методу Каммайна і Лайонса в модифікації Сміта. При додаванні до сироватки хворих з загрожуючим тромбозом розчину ?-нафтолу при наявності в ній фібриногену В приводить до випадання останнього у вигляді ниток, гранул або згортка.
Етаноловий тест проводився по методу Godal.Принцип його полягає в тому, що при наявності у дослідній плазмі заблокованих фібринмономерів, тобто їх комплексів з продуктами деградації фібриногену (продуктами фібринолізу) і фібриногеном, в плазмі під впливом етанолу утворюється драглистий згорток. Позитивний етаноловий тест свідчить про те, що в організмі йде дисеміноване або масивне локальне внутрішньосудинне згортання крові, яке супроводжується лізисом згортка. Тест використовується для діагностики синдромів ДВЗ.
Рівень Hb визначався за допомогою гемометра Салі. Норма 120-140 г/л.
Гематокритна величина визначалась по модифікації І.Тодорова. Норма 36-42%.
Тромбоцити - по Фоніо-додавання до крові консервуючої рідини (14% MgSO4), що попереджує аглютинацію кров`яних пластинок. Норма 200-400·10?9.
Тромбоцити вагітних досліджувались також електронномікроскопічно. Кров брали з ліктьової вени та поміщали у співвідношенні 1:1 у фіксатор (1% глютаровий альдегід на фосфатному буфері з цитратом натрію) на 30хв. Тромбоцити отримували після подвійного центрифугування крові: перше центрифугування - 10хв при 1000 об/хв; рідину над осадом вдруге центрифугують 10хв при 3000 об/хв. Осад після другого центрифугування, який місить тромбоцити, дофіксовува-ли розчином ОsО4 за Мілонігом на протязі 1 год, зневоднювали у спиртах зростаючої концентрації та ацетоні, заливали у суміш епона та аралдіта за загально прийнятою для електронномікроскопічних досліджень методикою (Карупу В.Я., 1984).
З метою діагностики патології перинатального періоду важливе значення набуває ультраструктурне дослідження плаценти.
Для електронномікроскопічного дослідження шматочки плаценти досліджуваної зони (область пуповини, середньої зони або краю органа) пре фіксувалась протягом 30хв. в холодному 2,5% розчині глютаральдегіду на 0,1 М фосфатному буфері з рН=7,4. Після подрібнення шматочків тканини плаценти гострою бритвою, додаткової фіксації 2,5% розчином глютаральдегіду протягом 30хв, промивання в фосфатному буфері, проводилась подальша фіксація 1% розчином осмієвої кислоти протягом 2 годин. Далі матеріал промивався в фосфатному буфері і зневоднювався в 50-, 60-, 70-ти градусному спиртах. В процесі зневожування для контрастування тканини в шматочках застосовувався 2% розчин ураніл ацетату на 70-ти градусному спирті. Потім шматочки плаценти зневожувався в спиртах зростаючої концентрації, ацетоні і ацетоні+смола (1:1), заливався в епонову або аралдитову смолу. Блоки з залитими шматочками тканини різались на ультрамікротомі. Отримані ультратонкі зрізи контрастувались азотнокислим свинцем і ураніл ацетатом і розглядались в електронному мікроскопі.
Математично розраховано достовірна кількість спостережень, блоків, проглянутих полів зору для отримання об'єктивних даних в електронній мікроскопії, де: кількість спостережень- не менше 4, кількість блоків- не менше 2. З кожного блоку зрізу готується не менше двох сіток. Площа ультра тонкого зрізу в середньому складає 0,15-0,20мм?2, на сітку вкладається 5-8 ультратонких зрізів.
При електронномікроскопічному вивченні плаценти особливу увагу приділялась ультраструктурі плацента
- Киев+380960830922