Антигенные свойства возбудителей чумы крупного рогатого скота и плотоядных, диагностика и специфическая профилактика инфекций

2
ОГЛАВЛЕНИЕ
Стр.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ 6
ВВЕДЕНИЕ 8
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 17
1.1. Краткая характеристика представителей рода
Morbillivirus 17
1.2. Краткая характеристика чумы крупного рогатого скота 19
1.3. Лабораторные методы диагностики чумы крупного
рогатого скота 24
1.4. Краткая характеристика чумы плотоядных 33
1.5. Лабораторные методы диагностики чумы плотоядных 35
1.6. Методы экспрессной диагностики вирусных инфекций 42
1.7. Средства и методы профилактики чумы плотоядных 52
1.8. Заключен ие по обзору л итературы 61
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 64
2.1. Вирусы и вируссодержащие материалы 64
2.2. Животные 65
2.3. Культуры клеток и питательные среды 66
2.4. Антисыворотки 67
2.5. Реактивы и препараты 69
2.6. Растворы химических веществ 70
2.7. Отбор и подг отовка проб испытуемого материала 71
2.8. Выделение гамма-глобулинов 73
2.9. Определение концентрации белка в препарата
иммуноглобулинов и ФИТЦ-конъюгатов 73
2.10.Методы серологических исследований 74
2.11 .Культивирование вирусов 76
2.12.Методы консервирования препаратов 76
2.13 .Статистическая обработка результатов исследований 77
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 78
3.1. АНАЛИЗ СЛУЧАЕВ ЗАБОЛЕВАНИЯ ЖИВОТНЫХ
ЧУМОЙ КРС В СНГ И ЧУМОЙ ПЛОТОЯДНЫХ в
КАЗАХСТАНЕ 78
3
3.2. ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННОЙ СТРУКТУРЫ ПОЛЕВЫХ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА ЧУМЫ КРС 86
3.3. РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СРЕДСТВ И МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ЧУМЫ КРС 89
3.3.1. Получение иммунных сывороток при чуме КРС и определение их серологической активности 89
3.3.2. Выделение иммуноглобулиновой фракции из иммунных сывороток и определение ее серологической активности 96
3.3.3. Отработка условий постановки
микромодификаций РСК для диагностики чумы крупного рогатого скота 100
3.3.4. Отработка условий приготовления диагностикумов и постановки ОА88-системы для диагностики чумы КРС 105
3.3.4.1. Получение антигельных иммуносорбентов на основе СЫВг-активированной сефарозы 4В 105
3.3.4.2. Определение варианта постановки ПА88-системы и получение специфических ФИТЦ-иммуноглобулинов 107
3.3.4.3. Отработка оптимальных условий постановки ОА88-системы 110
3.3.4.4. Постановка ОА88-сисгемы на основе эритроцитарного иммуносорбента 114
3.3.5. Отработка условий приготовления диагностикумов и постановки реакции агглютинации микродисперсии для обнаружения вирусспецифического антигена в органах и тканях больных и павших от чумы КРС сельскохозяйственных животных 116
3.3.5Л. Выбор носителя и получение на его основе антительного иммуносорбента 116
3.3.5.2. Определение оптимальных условий постановки РАМ и изучение ее специфичности 120
3.3.6. Изучение диагностической ценности
микромодификаций РСК, ОА88-системы и РАМ при обнаружении антигенов вируса чумы КРС 125
3.3.7. Отработка условий приготовления диагностикума и постановки реакции агглютинации латекса для обнаружения вирусспецифических антител в сыворотках крови переболевших
43
которые легко применимы в ветеринарной и медицинской практике. К таким методам относятся микромодификации РСК, РАЛ и ЭА88-система.
Микромодификации РСК. В последнее время для постановки и количественного учета РСК успешно применяют технику постановки реакции в малых объемах. Для этого используют наборы панелей с овальной конфигурацией лунок и калиброванных капельных пипеток систем Микротитр или Такачи. Реакцию ставят в объеме 0,125 мл, т.е. в 8 раз меньшем, чем при макрометоде. Каждый компонент берут в объеме 0,025 мл. Микрометод пригоден также и для титрования антигенов и сывороток.
Техника подготовки реагентов, приготовления стандартов и постановки реакции такая же, как и при макрометоде, с учетом уменьшенного объема компонентов.
Небольшой расход реагентов и быстрота разлива компонентов капельными микропипетками делают микрометод РСК очень удобным при постановке перекрестных реакций, когда определяют антигенное родство нескольких штаммов вируса [7].
РА88-система - метод твердофазового иммунофлуоресцентного анализа. Флуоресцентный метод зарекомендовал себя универсальным методом диагностики, поэтому постоянно ведутся исследования по его совершенствованию. В этом плане реализация идеи объединения преимуществ двух реакций - МФА и Р1ГГА, привела к созданию ОА8Б-системы ~ высокочувствительного и специфичного метода анализа на основе инертных носителей, в частности, СЫВг-активированной сефарозы и эритроцитов.
По данным ряда исследователей, растворимые антигены (антитела), ковалентно связанные с нерастворимыми носителями, не теряют способности взаимодействовать с гомологичными антителами (антигенами) [ 141,142,143,144,145].
Возможность использования при иммунофлуоресценции принципа афинной сорбнии впервые была показана К.Л.Шаханиной с сотрудниками [146,147,148,1491. Одним из главных компонентов афинного сорбента является носитель, обладающий необходимым количеством химически активных групп. Наиболее удобными с этой точки зрения оказались полисахаридные матрицы (агарозы и сефадексы), несущие на себе
44
гидрофильные группы и полиакриламидный гель с амидными группировками. Наиболее популярный в качестве афинной матрицы - 4% гель агарозы, активированной цианбромом - CNBr-сефароза - стабилен в диапазоне pH 4-9, обладает достаточной жёсткостью и не растворим в водных растворах, имеет сферическую форму гранул определённого диаметра. Этих свойств оказалось достаточно для создания на основе сефарозы DASS-системы [142,150,151,152].
Разработка метода применительно к различным конкретным целям нашла отражение во многих работах. Однако DASS-система как метод обнаружения и идентификации вирусспецифических белков до настоящего времени не имеет соответствующего признания и оценки. В литературе имеются лишь единичные сообщения об использовании этого метода в диагностике вирусных инфекций.
DASS-система на основе CNBr-сефарозы была испытана для диагностики лейкоза птиц [153]. Авторам удалось обнаружить вирус непосредственно в сыворотке крови, мышечных и эмбриональных экстрактах, смывах из клоаки. Это оказалось тем более ценным, так как в культурах клеток вирус выделить не удаётся. Метод оказался более чувствительным и эффективным, чем разработанные ранее методы диагностики этого заболевания.
Южук Т.Э.[154] разработала DASS-систему на основе активированной сефарозы для диагностики лихорадки долины Рифт и африканской чумы свиней. При этом оптимальное (85-87%) связывание lgG с матрицей достигалось при концентрации его 5-10 мг на I г. сефарозы. Но данным автора, DASS-система позволяет обнаруживать вирусы в жидких пробах, содержащих 3103 ТЦД5о/мл вируса. Применение DASS-системы позволило обнаружить вирус АЧС в пробах органов на 1-2 суток раньше, чем в РИГА, так как использование последней требует предварительного подращивания вируса в культуре клеток.
Эти данные согласуются с результатами других авторов в том, что, обладая высокой специфичностью, DASS-система не уступает при диагностике некоторых вирусных болезней, в частности, нарвовирусной инфекции свиней, по чувствительности ИФА, являясь дополнительной альтернативой РИА [142,143,152,153,155].
Rivera et al.(1986) в качестве сорбента при иммунофлуоресцентной диагностике парвовирусной инфекции свиней использовали