Количественная характеристика антителосекретирующих клеток в органах и тканях иммунной системы мышей в процессе иммуногенеза

ОГЛАВЛЕНИЕ
I. ВВЕДЕНИЕ......................................................................5.
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................10.
2.1. Общая характеристика органов и клеток иммунной системы................И.
2.2. Механизмы формирования иммунного ответа..............................20.
2.3. Иммунологические методы исследований.................................31.
2.4. Количественная оценка различных типов клеток иммунной системы ЕЫБРОТ-методом............................................................37.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ !..........................................................46.
4 РЕЗУЛЬТАТЫ РІССЛЕДОВАНИЙ......................................................54.
4.1. Разработка методов ЕЫБРОТ и ИФА для характер и стики гуморального иммунного ответа и определение общего количества ангителосекрсі ирующих
клеток у интактных беспородных мышей и мышей линии ВАЕВ/с.....................54.
4.1.1. Выделение, очистка и идентификация вирусных антигенов..............55.
4.1.2. Разработка непрямого и «сэндвич»-вариантов твердофазного ИФА.......57.
4.1.3. Разработка ЕЫ Б РОТ-метода для количественной характеристики АСК...58.
4.1.4. Количественная характеристика фСК, 1&М-, ^А-секретирующих клеток в лимфоидных органах интактных мышей........................................65.
4.2. Количественная характеристика антителосекретирующих клеток в органах и
тканях иммунной системы мышей в процессе иммуногенеза..........................68
4.2.1. Характеристика количественных изменений антителосекретирующих клеток в органах и тканях лимфоидной системы мышей при формировании иммунного ответа на вирусные антигены (ВТГС и РВ).........................68.
4.2.1.1. Характеристика иммунного ответа в периферических лимфатических узлах (паховых и подколенных)...........................................70.
4.2.1.2. Характеристика иммунного ответа в селезёнке....................73.
4.2.1.3. Характеристика иммунного ответа в косгном мозге................76.
4.2.1.4. Характеристика иммунного ответа в ЛТК..........................79.
4.2.1.5. Характеристика иммунного ответа в тимусе.......................81.
4.2.1.6. Динамика количественных изменений АСК в крови...................84
4.2.1.7 Динамика изменений титра вирус-специфических антител в
сыворотке крови иммунных мышей..........................................84.
2
4.2.2. Оценка иммуногенной активности вакцины против рожи свиней и характеристика количественных изменений антителосекретирующих клеток в
процессе иммунного отвега на бакгериальный антиген (Е.гііизіорайііае).....86.
4.2.2.1. Характеристика иммунного ответа в периферических лимфатических
узлах (паховых и подколенных)...........................................87.
4 2.2.2. Характеристика иммунного о твега в селезёнке...................91.
4 2.2.3. Характеристика иммунного ответа в костном мозге.................94
4.2.2 4. Характеристика иммунного ответа в лимфоидной ткани ассоциированной со слизистыми оболочками................................97.
4.2.2.5. Характеристика иммунного ответа в тимусе.......................99.
4.2.2.6. Количественная характеристика антителосекретирующих клеток в
смыве с перитонеальной полости.........................................102.
4.2.2.7. Количественная характеристика АСК в крови.....................103.
4.2.2.8. Определение уровня 1^, 1§М, в сыворотке крови мышей
после вакцинации и контрольного заражения..............................105.
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................109.
6 ВЫВОДЫ.........................................................................122
7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.....................................................124.
8 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................125.
3
Схема
X
н
X
Ш
< CQ О
§
С
С
о
X
Н
О
<• — ЛИМФОИДНАЯ Іі ^ В-ЛИМФОЦИТЫ -г Синтез антител, презентация антигена Т-лимфоцигам и их активация
* < J Т-ЛИМФОЦИТЫ Клеточный иммунитет, регуляция иммунного ответа
^ NK-K ЛЕТКИ Независимый лизис клеток-мишеней
* МИЕЛОИДНАЯ СТВОЛОВАЯ КЛЕТКА .--TV. »риті*;)! ііпьі Транспорт кислорода
* ТРОМБОЦИТЫ Свёртываемость крови
г МОНОЦИТЫ/МАКРОФАГИ Фагоцитоз, процессинг к презентация антигена
НЕЙТРОФИЛЫ Фагоцитоз, воспалительные процессы
* < * ЭОЗИНОФИЛЫ Противопаразигар1сая активность
—► Б АЗОФИЛЫ Воспалительные процессы
^ ТУЧНЫЕ КЛЕТКИ Секреция гистамина
Дифференцировочным антигенам по номенклатуре Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) дается название СО плюс порядковый номер. Аббревиатура CD (Claster Differentiation), расшифровываемая как кластер дифференцировки, обозначает группу антител, распознающих одну или несколько близких антигенных детерминант.
Необходимо отмстить, что ряд поверхностных молекул лимфоцитов, которые по сути являются дифференцировочными антигенами, не включены в список CD-антигенов. Это в первую очередь антигенраспознающие рецепторы как Т-лимфоцитов (TcR), так и 13-лимфоцитов (мембранные иммуноглобулины - mlg), а гак же антигены МНС. Все CD-антигены являются либо трансмембранными белками, либо белками, заякоренными на мембране.
Созревание и дифференцировку клеток иммунной системы обеспечивают цитокины, которые стимулируют клетку-предшественник путем связывания с сё поверхностными рецепторами. Цитокины - это низкомолекулярные белковые регуляторные вещества, продуцируемые клетками и способные модулировать их функциональную активность. При физиологическом состоянии в норме спектр их узок, но при стрессе, воспалении, повреждении, опухолеобразовании и др расширяется количественный и качественный состав цитокинов, обладающих как местной, так и дистантной (гормональной) активностью [Щепкин И. А., Гердынцева Н. В., Васильев Н. В., 1994]. Цитокины продуцируются различными клетками: эндотелиоцитами, кератиноцитами, фибробластами, макрофагами, нейтрофилами, лимфоцитами, тромбоцитами, стромальными и другими клетками [Зимина
12
И. В., Лопухин Ю. М., Арион В. Я., 1994.]. Основные цитокины, продуцируемые макрофагами и Т-клетками, представлены в таблице 1.
Таблица 1. Основные цитокины клеток иммунной системы
Цитокин Биологические функции
Цитокины макрофагов
IL-1 Основной костимулятор Тн2-клеток; Стимулятор продукции белков острой фазы иммунного ответа
IL6 Промотор диффсрсишфовки В-клеток (совместно с ІЬ-1 стимулирует синтез ^М. совместно с 1Ь-5 -І&А); Стимулятор продукции белков острой фазы иммунного ответа пспатоцитами, при этом функционирует как пп}х>ген
IL-12 Основной костимулятор Тії 1 -клеток (усиливает пролиферацмо и цитотоксичеекие функции Г и ЫК-клеток); Подавляет продукцию І&Е посредством сутірсссии 11,-4
TNF-a Обладает цкготоксичсским действием и запускает механизм апоптоза некоторых опухолевых клеток; Стимулятор роста Т-клеток, Медиатор воспаления и многих других иммунных реакций
Цитокины Thl-клеток
IL-2 Спсмулирует пролиферацию и цитотококчесхую активность Т- и МК-клсток; Активирует В-клетки и стимулирует синтез иммуноглобулинов; Акгцпирует макрофаги, стимулирует секрецию ими цитокинов и усиливает цитотокеическую активность против раковых клеток и внутриклеточных бактерий
IFN-y Стимулирует ТЫ -клетки; Активирует ЫК-клетки; Активирует макрофаги, в очень большой степени усилинает их способность разрушать чужеродные микроорганизмы; Стимулирует антитело-о1 юередованный фагоцитоз
TNF-p Активирует 098+ 'Г-клетки, Активирует нейтрофилы, макрофаги, эндотелиальные клетки и В-лимфоциты
Цитокины Т1і2-клеток
IL-4 Стимулирует рост и дифференциацию В-клеток, индуцирует изотопическое переключение В-кдеток на продукцию 1^Е; Стимулирует развитие ЦТ Л из покоящихся Т-клеток
IL-5 Стимулирует рост В-клеток; Стимулирует рост и активацию эозинофилов, Индуцирует циготоксическую активность Т-клеток
IL-9 Индуцирует рост ТЪ-клонов и тучных клеток, происходящих из костного мозга
IL-10 Ингибирует функции Т111- и МК-клсток, Су пресс ирует секрецию цитокинов активированными макрофагами
IL-13 Обладает биологической активностью подобной 1Ь-4, стимулирует пролиферацию В-клеток, стимулирует нейтрофилы, оказывая, таким образом, противовоспалительное действие; Супрессирует функции макрофагов
Действие их реализуется по сетевому принципу, то есть передаваемая клеткой информация содержится не в индивидуальном пептиде, а в наборе регуляторных цитокинов. При этом цитокины действуют либо в отношениях синергизма, либо антагонизма, каскадно индуцируют выработку друг друга, трансмодулируют поверхностные рецепторы к другим медиаторам [Sportn М., Roberts А., 1988; Galve-de Rochemonteix В., Wiktorowicz К , Kushner I. et al., 1997; Ковальчук Л. В., Ганковская Л. В., 1995]. Стимулирующее или ингибирующее
13