Разработка РИД-тест-системы для диагностики бруцеллеза собак, вызываемого B. canis

2
СОДЕРЖАНИЕ
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Характеристика бруцеллеза собак, вызываемого 9
В. сапів
1.2. Характеристика возбудителя 10
1.2.1. Антигенное строение В. сапІБ 12
1.3. Ангителообразование при бруцеллезе собак, вызывае- 14
мом В. сапІБ
1.4. Восприимчивость человека к инфекции В. сапів 16
1.5. Диагностика бруцеллеза собак, вызываемого В. сапів 17
1.5.1. Реакция иммунодиффузии 25
1.5.1.1. Диагностика бруцеллеза собак, вызываемого В. сапів, в 26
РИД
1.6. Бактериологическая диагностика бруцеллеза собак, 30
вызываемого В. сап і б
1.7. Лечение и профилактика 32
ГЛАВА 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 37
2.1. . Материалы и методы 37
2.2. Методики проведения экспериментов 39
2.2.1. Разработка схемы получения диагностической 39
гипериммунной бруцеллезной К-сыворотки
2.2.2. Разработка метода получения антигена для диагности- 43
ки бруцеллеза собак, вызываемого В. сапів, в РИД
2.2.2.1. Получение антигена «солевым методом» 43
3
2.2.2.2. Получения антигена «ультразвуковым» методом 45
2.2.3. Изучение факторов, влияющих на активность 46
УЗДЫ-антигена для РИД
2.2.3Л. Повышение активности антигена путем осаждения бел- 46 ков растворами ТХУ и трипсина
2.2.4. Стандартизация антигена для РИД 48
2.2.5. Изучение специфичности антигена для РИД 48
2.2.6. Испытание «Тест-системы для диагностики бруцеллеза 49
собак, вызываемого В. саше, в РИД» в производственных условиях
2.2.7. Бактсриологическое исследование крови собак 49
2.2.8. Изучение свойств выделенных штаммов В. саше 50
2.3. Результаты исследований 54
2.3.1. Отработка схемы получения диагностической гипс- 54
риммуиной бруцеллезной Я-сыворотки
2.3.2. Разработка способа получения бруцеллезного И.- 58
антигена для диагностики бруцеллеза собак в РИД
2.3.3. Результаты стандартизации антигена для РИД 73
2.3.4. Специфичность антигена для РИД 74
2.3.5. Результаты лабораторных испытаний антигена для ди- 75
агностики бруцеллеза собак, вызываемого В. сатя, в
РИД
2.3.6. Результаты производственных испытаний антигена для 83
диагностики бруцеллеза собак, вызываемого В. саше, в РИД
11
среде колонии В. canis серовато-белые, влажные, блестящие и просвечивающиеся. В косом отраженном свете у колоний наблюдается опалесценция. Культура становится мукоидной примерно через 2 недели инкубирования. Колонии имеют тенденцию к адгезии на поверхности агара и с трудом снимаются с него [37, 45]. В первой генерации колонии В. canis неоднородные, наряду с колониями обычного размера встречаются «карликовые». На трип-тозном бульоне в первые сутки культивирования наблюдается равномерное помутнение; через 48-72 часа формируется веревочный вязкий осадок. Пленка на поверхности бульона при первичном выделении не формируется [35, 91].
Многие авторы выделяют следующие метаболические характеристики
В. canis [20,35, 56, 91, 98, 118, 124, 135, 136]:
1) ферментирует углеводы D-рибозу, D-глюкозу, D-галактозу (некоторые штаммы), i-эритрит (некоторые штаммы) и не ферментирует D-ксилозу;
2) окисляет аминокислоты - L-глютамат, L-аргинин, L-цитруллин, L-лизин, DL-орнитии, L-аланин (некоторые штаммы) и не окисляет L-аспарагин;
3) не продуцирует сероводород.
Однако по данным Carmichael L.E. [47], Carmichael L.E. и Burner D.W. [46], выделенная авторами культура В. canis продуцировала H2S в следовых количествах через несколько суток роста. Forbes L.V. и Panteckoek J.F. [72] проводили сравнительное изучение полевых и референтного штаммов В. canis и также отметили, что культуры всех штаммов через 5 суток культивирования выделяли сероводород в небольших количествах.
Культуры штаммов В. canis дают отрицательные результаты в РА с S-антибруцеллезньми, А- и М- моиорецепторными сыворотками и агглютинируются R-антибруцеллезными сыворотками [24, 35, 98].
. Культура В. canis устойчива к тионину (максимальная концентрация краски - 1:25000) и не растет на средах с добавлением основного фуксина [98]. В то же время, Carmichael L.E. и Burner D.W. [46] сообщали в своих ис-
12
следованиях о росте культуры В. cam's на среде, содержащей основной фуксин в концентрации 1:100000. В литературе описаны штаммы, которые растут в присутствии основного фуксина в концентрации 1:25000 [47, 64, 67].
По данным Jones L.M. et ab [100] и Alton G.G. et al. [35] культура В. canis чувствительна к росту па среде с добавлением пенициллина (5 ЕД/мл). Однако в Мексике в конце 70-ых годов от больных бруцеллезом собак был выделен штамм В. canis, который отличался по своей чувствительности к краскам и пенициллину. Он давал стойкий рост на средах, содержащих основной фуксин, о-сафранин, голубой тионин и пенициллин в таких концентрациях, которые задерживали рост референтного штамма RM 6/66. Кроме того, в отличие от референтного, этот штамм утилизировал эритритол [67]. По мнению ряда исследователей, этот штамм, названный МЕХ 51, можно условно считать референтным штаммом второго биовара вида В. canis [64, 67].
Культура В. canis резистентна к действию фагов Tb, Wb, ВК2 и Fi. В то же время, не все фаги, которые лизируют культуры, находящиеся в R-форме, оказывают действие на Я canis [98].
1.2.1. Антигенное строение В. canis
Pamas J. [135, 136] в своих работах отмечал, что R-формы бруцелл содержат меньшее количество антигенных компонентов, чем S-формы. Этот вывод был сделан им на основании результатов двойной диффузии в геле, где было установлено 3-4 линии преципитации с антигенами из R-форм и 5-6 линий преципи тации из S-форм бруцелл.
И:И.Дубровская [10, 11], изучая антигены S- и R-форм бруцелл, установила, что в структуре R-штаммов обнаруживалось меньше белковых веществ. Аминокислоты R-форм, в отличие от S-культур, не содержали лизина, оксипролина, тирозина, альфа-аминомасляной кислоты, метионина, фенилаланина. В полисахаридах R-форм, в отличие от полисахаридов S-форм, не было обнаружено галактозы и дезоксигектозы, но был выявлен новый компонент - ксилоза.