Разработка культуральной инактивированной вакцины против вирусной лейкемии кошек

V
ОГЛАВЛЕНИЕ
Оглавление............................................................I
Список используемых сокращений....................................4
1. Введение...........................................................6
2. Обзор литературы..................................................11
2.1. Характеристика возбудителя вирусной лейкемии кошек..............11
2.1.1 История........................................................11
2.1.2 Таксономия и классификация возбудителя.........................11
2.1.3 Вирион и структура генома......................................11
2.2. Эпизоотология заболевания.......................................14
2.3. Особенности патогенеза..........................................18
2.4. Клинические симптомы............................................24
2.5. Методы диагностики вирусной лейкемии кошек......................27
2.6. Лечение.........................................................33
2.7. Средства специфической профилактики.............................36
3. Собственные исследования..........................................44
3.1 Материалы и методы...............................................44
3.1.1 Вирусы, культуры клеток и питательные среды....................44
3.1.2 Определение количества и жизнеспособности клеток...............44
3.1.3 Криоконсервация культуры клеток................................45
3.1.4 Инактивация вируса.............................................45
3.1.5 Адъюванты......................................................45
3.1.6 Определение стерильности.......................................46
3.1.7 Экспериментальные животные.....................................46
3.1.8 Выделение РНК.......*..........................................46
3.1.9 Амплификация и клонирование гена gp70 в Е.соП.................47
3.1.10 Приготовление питательной среды ЫЗ и Ь-агара..................48
3.1.11 Получение компетентных клеток.................................48
3.1.12 Трансформация компетентных клеток Е.соП.......................49
3.1.13 Наращивание...................................................49
3.1.14 Индукция......................................................50
3.1.15 Сыворотки.....................................................50
3.1.16 Очистка рекомбинантного белка 1£р70 методом металло-хелатной аффинной хроматографии (МХАХ)........................................50
3.1.17 Определение концентрации белка................................51
3.1.18 Оценка иммунологической активности белка ^р70.................52
3.1.19 Учет и интерпретация результатов ИФА..........................52
3.1.20 Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ПААГ-ДСН)...........................................................53
3.1.21 Статистическая обработка результатов........................54
3.2 Результаты собственных исследований..............................55
3.2.1 Изучение условий культивирования культуры клеток И422..........55
3.2.2 Инактивация вируса.............................................58
3.2.3 Определение антигенной активности культуральной инактивированной вакцины против ВЛК на лабораторных животных 59
3.2.4 Определение антигенной активности культуральной инактивированной вакцины против ВЖ на кошках.........................62
3.2.5 Изготовление и контроль опытных серий вакцины против вирусной лейкемии кошек.......................................................67
3.2.6 Получение и характеристика рекомбинантного оболочечного гликопротеина ВЛК gp70 (^р70)........................................69
3.2.7 Разработка тест-системы по определению антител к оболочечному гликопротсину вируса лейкемии кошек gp70.............................73
8
напряженного и длительного иммунитета к ВЛК у иммунизированных животных.
6. Получить рекомбинантный белок ^р70 вируса лейкемии кошек и использовать его в имму но ферментном анализе для определения уровня антител к §р70 ВЖ в сыворотке крови кошек.
1.3.Научная новизна. Изысканы оптимальные условия культивирования перевиваемой хронически инфицированной вирусом лейкемии кошек культуры клеток и определены оптимальные условия его накопления.
Отработаны режимы инактивации вируса.
Разработана схема изготовления культуральной инактивированной вакцины против ВЖ.
Определена безвредность и антигенная активность культуральной инактивированной вакцины против ВЖ на кроликах и кошках.
Изучено влияние хранения на антигенную активность вакцины.
Подобраны праймеры для амплификации гена gp70.
Получен и охарактеризован рекомбинантный оболочечный гликопротеин вируса лейкемии кошек (г§р70).
Разработана иммуноферментная тест-система для выявления вирус-специфических антител к оболочечному гликопротеину §р70 ВЛК в сыворотке крови кошек.
1.4.Практическая ценность работы. Разработана безвредная и эффективная инактивированная вакцина против вирусной лейкемии кошек.
Научно обоснованы принципы изготовления и.биологического контроля инактивированной вакцины против вирусной лейкемии кошек.
Экспериментально установлена иммунизирующая доза препарата, показана возможность оценки антигенной активности на лабораторных и естественно-восприимчивых животных.
Разработана нормативная документация на культуральную инактивированную вакцину против вирусной лейкемии кошек.
Разработана иммуноферментная тест-система для определения уровня антител к §р70 ВЛК в сыворотке крови кошек.
1.5.0сновные положения, выносимые на защиту. Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения:
схема изготовления и методы биологического контроля вакцины против вирусной лейкемии кошек,
- результаты исследований по изучению антигенных свойств культуральной инактивированной вакцины против ВЛК на лабораторных и естественно-восприимчивых животных,
- разработка иммуноферментной тест-системы по определению уровня антител к оболочечному гликопротеину gp70 ВЖ в сыворотке крови кошек.
1.6.Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: 6-ой Международной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (2007); 7-ой Международной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (2008); 2-ой ежегодной конференции молодых ученых ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН; заседании Ученого совета МГУПБ (2009), межлабораторном совещании МГУПБ.