СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ...............................................................7
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................11
1.1 Морфология Bacillus anthracis..................................11
1.2 Секретируемые факторы вирулентности Вас.anthracis..............13
1.3 Сибирская язва и её диагностика................................15
1.4. Иммунитет и иммунизация.......................................18
1.5. Производство моноклональных антител и их практическое применение. ................................................................25
1.5.1. Применение моноклональных антител........................26
1.5.2. Диагностика бактериальных инфекций.......................27
1.5.3. Перспективы терапевтического применения..................30
1.5.4. Принципы получения моноклональных антител................31
1.6. Применение МкАт для изучения сибирской язвы и её обнаружение в объектах исследования...........................................35
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ..............................................37
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...........................................37
2.1. Лабораторные животные.........................................37
2.2. Антигены......................................................37
2.3. Штаммы........................................................38
2.4. Сыворотки, антитела...........................................38
2.5. Антисыворотки.................................................38
2.6. Иммунизация...................................................38
2.7. Приготовление ультразвуковых дезинтегратов микробных клеток 39
2.8. Синтез конъюгатов антител с пероксидазой хрена................39
2.9. Миеломные клетки..............................................40
2.10. Культуральные среды.................................;........40
2.11. Посуда.......................................................41
2.12. Подготовка миеломных клеток к слиянию........................41
2.13. Приготовление слоя фидерных (подкормочных) клеток............41
2.14. Получение иммунных спленоцитов...............................42
2.15. Раствор полиэтиленгликоля....................................42
2.16. Гибридизация клеток..........................................42
2.17. Отбор гибридных культур-продуцентов специфических антител (первичное тестирование)........................................43
2.18. Клонирование гибридных клеток................................43
2.19. Заморозка и разморозка гибридных и миеломных клеток..........44
2.20.Культивирование гибридных клеток in vivo......................44
2.21. Очистка моноклональных антител...............................45
2.22. Использование штаммов гибридных культивируемых клеток для получения моноклональных антител................................45
2.23. Исследование специфичности иммунохимических свойств МкЛт 46
2.23.1. Твердофазный иммуноферментный анализ....................46
2.23.2. Иммуноблотгинг..........................................47
2.23.3. Определение изотипа МкАт................................47
2. 24. Определение концентрации белка...........................47
2. 25. Статистическая обработка результатов.....................48
ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К АНТИГЕНАМ Вас. anthracis, ИХ ВЫДЕЛЕНИЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА........................................................49
3.1. Иммунизация...................................................49
3.2. Подбор условий постановки твердофазного иммунофермент-ного анализа (ИФА)...................................................51
3.3. Гибридизация..................................................52
3.3.1. Подготовка клеток к слиянию, гибридизация................52
3.3.2. Получение первичных культур гибридных клеток.............52
3.3.3. Получение гибридом при использовании спленоцитов мышей, иммунизированных дезинтегратом спор вакцинного сибиреязвенного штамма 55 - ВНИИВВиМ......................................53
3.3.4. Получение гибридом при использовании спленоцитов мышей, иммунизированных дезинтегратом вегетативных клеток (суточной культурой) вакцинного сибиреязвенного штамма 55 - ВНИИВВиМ 55
диагностических тест-системах в сравнении с поликлональными антителами обеспечивает получение более стабильных результатов при сохранении высокой чувствительности и специфичности, а стабильность свойств МкАт является определяющим фактором изготовления стандартных образцов препаратов в достаточно больших количествах. [35, 108].
Существующая потребность в более совершенных методах диагностики, выявления Bacillus anthracis и его токсических субстанций позволило нам определить следующую цель работы.
Цель работы
Получить панель гибридом-продуцентов антител к специфичным антигенам Вас.anthracis и исследовать возможность их применения для иммунохимического анализа сибиреязвенных антигенов и конструирования диагностику мов.
Задачи исследования
При выполнении работы необходимо было решить следующие задачи:
1. Провести культивирование сибиреязвенного возбудителя и сапрофитных бацилл и приготовить антигенные препараты для иммунизации животных и тестирования гибридом.
2. Подобрать схемы иммунизации мышей антигенными препаратами Bacillus anthracis оптимальные для получения гибридом-продуцентов.
3. Получить гибридомы-продуценты моноклональных антител к
видоспецифичным антигенам Bacillus anthracis.
4. Изучить иммунохимическую характеристику и эффекторные свойства моноклональных антител.
5. Разработать методы использования моноклональных антител для
качественного и количественного определения распознаваемых ими антигенов.
Научная новизна
Создана оригинальная коллекция стабильных гибридом-продуцентов моноклональных антител к протективному антигену Bacillus anthracis.
Представлены доказательства преимущества применения тестов на основе моноклональных антител по сравнению с классическими методами диагностики и идентификации возбудителя.
Положения, выносимые на защиту
Получение оригинальной коллекции технологичных клонов гибридом-продуцентов антител к протективному антигену сибиреязвенного микроба.
На основе полученных моноклональных антител разработаны специфичные и чувствительные иммуноферментные методы качественного и количественного определения протективного антигена сибиреязвенного токсина в биологическом материале и метод выявления антител к протективному антигену в сыворотке вакцинированных животных.
Апробация работы
Материалы, изложенные в диссертации, доложены:
• на VIII Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2004» 23-25 мая 2004 г.
• На межлабораторном совещании специалистов ФГУ ВГНКИ 31 мая 2005 года.
• На межлабораторной конференции ГУ НИИВС им. И. И. Мечникова 3 июня 2005 года.
По материалам диссертационной работы опубликовано в периодической печати 3 научные статьи.
Структура диссертации
Диссертация изложена на 98 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, четырёх глав собственных исследований,
- Київ+380960830922