Содержание
1. Введение.........................................................4
2. Глава 1. Литературный обзор.....................................10
3. 1.1 Лазерный оптический «пинцет»..................................................................10
4. 1.1.1 Принцип действия оптического манипулятора................10
5. 1.1.2 Обзор применений методики оптического «пинцета»...........12
6. 1.1.3 Новые возможности оптического манипулирования -голографический оптический «пинцет».............................17
7. 1.2 Фемтосекундный лазерный скальпель для биологических объектов 23
8. 1.2.1 Классификация механизмов воздействия лазерного излучения на биологические объекты 23
9. 1.2.2. Примеры экспериментального использования фемтосекундного лазерного скальпеля 30
10. 1.3 Возможность использования лазерных технологий в клеточной инженерии 33
11. Глава 2. Реализация экспериментальных методик: фемтосекундный «манипулятор-скальпель» и глографический «манипулятор-скальпель» с использованием фемтосекундного и непрерывных лазеров............37
12. 2.1 Экспериментальная установка фемтосекундного«манипулятора -скальпеля» 37
13. 2.2 Экспериментальная установка голографического «манипулятора-скальпеля» с использованием фемтосекундного и непрерывных лазеров.39
14. Глава 3. Теоретическое рассмотрение фемтосекундного оптического пинцета и голографического манипулятора.........................46
15. 3.1 Оптический захват и манипулирование мезоскопической частицей фемтосекундным лазером 46
16. 3.1.1 Движения частицы в потенциальной яме под действием света..46
17. 3.1.2 Эффект движения потенциальной ямы........................48
18. 3.2 Отражение фемтосекундного лазерного импульса от пространственного оптического модулятора........................50
19. 3.2.1 Метод вычислений 51
20. 3.2.2 Результаты вычислений ...................................54
21. Глава 4. Экспериментальные результаты по оптическому манипулированию и лазерной микрохирургии........................56
22. 4.1 Микрохирургическое воздействие фемтосекундным «скальпелем» ..............................56
23. 4.1.1 Воздействие на скопление раковых эпителиальных клеток 56
24. 4.1.2 Эксперименты с единичным нейроном и нервным волокном....58
25. 4.1.3 Фемтосекундная оптоперфорация стенки цианобактерии АпаЬаепа эр. РСС 7120 в присутствии наночастиц золота...........64
2
26. 4.1.4 Воздействие на метафазную пластинку ооцита мыши-фемтосекундная энуклиация 78
27. 4.1.5 Слияние бластомеров в двухклеточном эмбрионе фемтосекундным «скальпелем»........................................80
28. 4.2 Оптический захват и манипулирование при помощи фемтосекундного и непрерывного лазера..............................81
29. 4.2.1 Оптическое манипулирование единичной клеткой.............81
30. 4.2.2 Манипуляции единичным нервным волокном...................83
31. 4.2.3 Манипулирование многими объектами одновременно...........85
32. 4.2.4 Одновременное использование фемтосекудного «скальпеля» и оптического манипулирования непрерывным лазером....................86
33. 4.3 Микрохирургия при помощи диодного лазера...................86
34. Глава 5. Технология получения «чистых линий» генетически модифицированных животных и неинвазивного лазерного терапевтического клонирования .....................................88
35. 5.1 Технология получения химерных животных и «чистых линий» животных 88
36. 5.1.1 Получение «чистой линии» из двухклеточного (двухбластомерного) эмбриона ......................................90
37. 5.1.2 Получение «химеры» из доимплантного эмбриона.............94
38. 5.2 Неинвазивная методика фемтосекундного лазерного терапевтического клонирования .....................................96
39. Заключение 104
40. Список литературы ...............................106
3
Введение.
Диссертационная работа посвящена экспериментальному и теоретическому изучению взаимодействия лазерного излучения с искусственными и биологическими мезоскопическими объектами. Основной задачей работы является исследование взаимодействия остросфокусированных лазерных пучков с эмбриональными клетками и разработка экспериментальных методик. Актуальность работы определяется фундаментальным интересом к механизмам взаимодействия сверхкоротких лазерных (фемтосекундных) импульсов с биологическими объектами, что связано с развитием новых клеточных биотехнологий.
Со стороны остро сфокусированного лазерного пучка в условиях значительного градиента интенсивности светового поля на мезоскопический объект размером от десятком нанометров до сотен микрон действуют силы, втягивающие объект в область перетяжки пучка. Сфокусированный лазерный пучок способен захватить мезоскопический объект в так называемую оптическую ловушку. С помощью оптической ловушки можно осуществлять манипулирование объектом в пространстве, т.е. оптическая ловушка выполняет функцию лазерного пинцета[1]. Лазерные пинцеты с использованием непрерывных или наносекундных импульсных лазеров с высокой частотой следования импульсов нашли широкое применение в работе с мезоскопическими биологическими объектами. Сегодня этот метод уже находит множество применений: перемещение золотых наночастиц размером больше 10 нм [2]; измерение потоков жидкости в микроскопических объектах [3]; сортировка клеток, бактерий [4]; измерение сил адгезии между двумя клетками[5]; создание сложных трёхмерных биологических структур[6]; разработка направленной доставки и прицельного воздействия на биологические мишени; измерение силы, необходимой для разрыва двойной спирали ДНК[7]; манипулирование отдельными органеллами внутри живой клетки [8]. В диссертационной
4
работе показано, что в качестве лазерного пинцета с успехом может использоваться фемтосекундный лазер с достаточно высокой частотой следования импульсов.
Дальнейшее развитие методики лазерного пинцета привело к появлению голографического оптического манипулятора, который обладает возможностью создавать и динамически управлять множеством оптических ловушек. Разработка этого устройства стала возможна благодаря революционным изменениям в области адаптивной оптики. Основная идея работы голографического оптического манипулятора заключается в том, что множество оптических ловушек создаётся при помощи управляемого компьютером пространственного оптического модулятора. Это устройство представляет собой зеркальную жидкокристаллическую матрицу. Голографический принцип её работы состоит в том, что каждый элемент матрицы можно запрограммировать на определённую фазовую задержку лазерного излучения. После того, как лазерный луч отражается от такого модулятора, изначально плоский фронт лазерного излучения преобразуется соответственно распределению фазовых задержек на матрице. Далее, этот преобразованный луч проходит через линзу объектива и фокусируется в заранее запрограммированную трехмерную «картинку». Таким образом, мы можем получить уже не одну оптическую ловушку, а множество независимо и трёхмерно управляемых оптических ловушек, программируя модулятор на фокусирование луча в соответствующее количество точек.
Одной из главных задач данной работы является разработка и создание
голографического оптического манипулятора и «скальпеля» с применением
фемтосекундных лазерных импульсов. Необходимость использования
фемтосекундных импульсов обусловлена несколькими причинами. Во-
первых, под действием лазерных импульсов фемтосекундной длительности
эффективно осуществляется многофотонное поглощение даже при
незначительных энергиях импульса. В результате многофотонного
поглощения образуются возбужденные молекулы в высоких электронных
5
состояниях, с участием которых происходят различные физико-химические процессы, ведущие к распаду молекул и деструкции материала. Это позволяет использовать фемтосекунлные импульсы как оптический скальпель. Второе важное преимущество использования фемтосекундных импульсов заключается в том, что дессекцию, абляцию и микрохирургию различных биологических объектов можно проводить с минимальным разогревом, а иногда и без него. Третье, для многофотонного поглощения можно использовать фемтосекундные импульсы ближнего инфракрасного диапазона, в котором находиться окно прозрачности для биологических объектов.
Особый интерес фемтосекундные лазеры представляют для клеточной инженерии и клеточной микрохирургии. Интенсивное развитие лазерных технологий и биофотонной инженерии способствовало широкому использованию этих методов в биологических исследованиях, в том числе в клеточной биологии. Возможность использования лазерных технологий в клеточной биологии и биологии развития принципиально была показана еще несколько десятилетий назад [9-11]. Интересно отметить, что одно из первых исследований по лазерной микрохирургии на отдельной клетке было проведено на ранних эмбрионах млекопитающих, предимплантационных эмбрионах кролика [9], но эта микрохирургия заключалась только в разрушении отдельных бластомеров. В настоящее время лазерные методы достаточно интенсивно используется в медицинских центрах по искусственному оплодотворению и трансплантации эмбрионов человека. Лазером перфорируют прозрачную оболочку ооцита: для уменьшения травматических последствий при введении микроиглой сперматозоида [12, 13] для облегчения вылупления эмбриона из прозрачной оболочки [14, 15], для минимизации травматизма при биопсии доимплантационных эмбрионов [16, 17]. Эта же операция, по лазерной перфорации блестящей оболочки ооцита, использовалась при трансплантации ядер [18] и получении химерных
6
животных [19]. Недавно лазер был использован для выделения внутренней клеточной массы (ВМК) из бластоцист млекопитающих [20,21].
Многие болезни человека определяются наследственностью. На современном уровне развития медицины диагностика и лечение подобных заболеваний требует создание и изучение моделей таких болезней. Создание моделей болезни позволит понять механизм возникновения и развития патологии, выявить роль различных генов в этом процессе. Для разработки моделей болезни требуются модельные животные. Наиболее подходит для этих целей - лабораторная мышь. Поэтому разработка эффективных технологий получения чистых линий генетически модифицированных мышей является сегодня крайне актуальной проблемой биомедицины.
Мышь является наиболее адекватным модельным животным поскольку: является хорошо изученным и доступным объектом; геном мыши и человека содержит приблизительно одинаковое число генов; сходство аминокислотных последовательностей всех белков человека и мыши составляют около 90%. Основной причиной использования мыши в качестве модели для инактивации гена является возможность изолирования эмбриональных стволовых клеток, в которых любой ген может быть модифицирован. Современный подход получения линии генетически модицифированных мышей заключается в следующем. Клеточные линии, содержащие модифицированный ген, вносятся в развивающийся зародыш на стадии бластоцисты, что позволяет получить химерное животное, несущее искусственно созданную мутацию. В последующем, скрещивая химерных животных, получают чистую, модельную линию модифицированных мышей, которая и является объектом последующего изучения.
Разработка технологии получения линий генетически модифицированных мышей, путем введения трансформированных эмбриональных стволовых клеток в ранние доимплантационные эмбрионы, с применением только лазерной, неинвазивной микрохирургии направлена на
7
усовершенствование традиционно используемого на сегодняшний день метода введения стволовых клеток с модифицированным геномом в эмбрионы мышей, при создании моделей социально значимых заболеваний. Для достижения поставленной цели необходимо решение нескольких задач, в том числе по созданию лазерного микроманипулятора с функциями лазерного скальпеля и пинцета; подбора оптимальных, необходимых параметров манипулятора; отработка технологии трансплантации эмбриональных стволовых клеток, в том числе в тетраплоидные и гексаплоидные эмбрионы. Применение лазерной микрохирургии, в том числе возможность получения тетраплоидных эмбрионов, позволит эффективно проводить операции по получению как модифицированных химерных мышей, так и с большой вероятностью, получение сразу чистых линии, без потери времени и затрат на последующее скрещивание химер.
В процессе выполнения диссертационной работы разработана и реализована не имеющая аналогов экспериментальная установка лазерного манипулирования микрообъектами, с использованием фемтосекундного и непрерывных лазеров. Таким образом, реализован новый метод оптического манипулирования, совмещающий возможности фемтосекундного лазерного скальпеля и «голографического оптического пинцета».
В данной работе выполнена разработка экспериментальных методов лазерной нанохирургии с использованием множества лазерных «скальпелей» и «пинцетов», сформированных методами динамической голографии, с использованием фемтосекундного и непрерывного лазерного излучения с различными спектральными характеристиками. Методики, разработанные на основе полученных в ходе работы данных, имеют непосредственное прикладное значение в биологии, медицине и фармацевтике. Предложенная новая технология получения генетически модифицированных животных («чистые линии») находится на стадии патентования.
Получение индивидуальных эмбриональных стволовых клеток
человека и на сегодняшний день является актуальнейшей задачей
8
современной биомедицины. Одним из важнейших результатов работы является демонстрация возможности использовать разработанную методику лазерного манипулирования для проведения терапевтического клонирования, т.е. получения индивидуальных эмбриональных стволовых клеток.
Данная работа решает следующие задачи:
1. Исследовать возможность использования фемтосекундных лазерных импульсов для реализации оптического манипулирования мезоскопическими объектами и осуществления активного физикохимического воздействия на объект изучения.
2. Разработать и реализовать новую методику голографического оптического манипулирования мезоскопическими объектами с использованием фемтосекундных импульсов, исследовать возможности и ограничения новой методики.
3. Разработать фундаментальные основы технологии получения генетически модифицированных животных при помощи лазерного манипулятора с использованием принципов многофотонной фотохимии.
4. Разработать фундаментальные основы технологии терапевтического клонирования с использованием методов лазерного манипулирования мезоскопическими объектами.
9
- Київ+380960830922