СОДЕРЖАНИЕ
СТР.
ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА I Литерату рный обзор 9
1.1 Радиационная инактивация протеолитичсских ферментов 9
1.1.1 Сериновые протеиназы 9
1.1.2 Сульфгидрильные протеиназы 22
1.1.3 Другие типы протеиназ 27
1 2 Свойства ангиотензин-превращающего фермента 33
1.3 Структурные и радиационные свойства
пероксидаз растений 38
1.4 Применение метода радиационной инактивации 53
ГЛАВА II Материалы и методы 55
ГЛАВА III Экспериментальные результаты и
обсуждение 74
3 .1 Характерные виды дозовых зависимостей при
радиолизе ферментов 74
3 1.1 Протеиназы 74
3 12 Ангиотензин-превращающий фермент 84
3.1.3 Пероксидазы растений 95
3.2 Зависимость дозового ответа от pH раствора 103
3.2.1 Протеиназы 104
3.2.2 Ангиотензин-превращающий фермент 114
3.2.3 Растительные пероксидазы 124
3.3 Влияние среды на дозовый ответ 130
3.4 Изменение субстратной специфичности под действием облучения 141
3.4.1 Протеиназы 141
3.4.2 Ангиотензин-превращающий фермент 143
3.4.3 Пероксидазы растений 143 . 3.5 Сравнительное изучение методом радиационной
инактивации мутантных форм пероксидазы хрена 157
3.6 Влияние некоторых ионов на конформацию
и дозовый ответ ферментов 211
3.6.1 Влияние ионов кальция на протеиназы 211
3.6 2 Влияние ионов кальция и магния на
пероксидазы растений 214
3.6.3 Влияние концентрации соли NaCl на дозовый ответ ангиотензин-превращающего фермента 224
3.6.4 Влияние концентрации NaCl на дозовый ответ
пероксидазы хрена
3.6.5 Влияние ионов цинка на стабильность и дозовый ответ ангиотензин-превращающего фермента
3.7 Математическая модель для обоснования появления активации и чередующихся эффектов (осцилляций) на дозовых кривых
3.8 Дозовый ответ ферментов при малых дозах облучения на источник типа плазменный фокус
3.9 Возможные применения метода радиоэнзимологии в дозиметрической и медицинской диагностике
ВЫВОДЫ
Приложение
Основные положения диссертации, вынесенные на защиту
Обозначения
Список литературы
цистеином, характерная для сульфгидрильных ферментов, выше. По сравнению с сериновыми протеиназами БН-содержащие ферменты, как правило, более радиационно-чувствительны из-за описанной выше совокупности процессов инактивации Присутствие цистеина в облучаемом растворе способно уменьшать величину инактивации папаина, отчасти за счет реакции: папаин + Суэ-БН папаин-Н + СуБ-8 При этом защита цистеином зависит от реального отношения [папаин]/[цистеин]. Так, в очищенных азотом растворах оно должно сотавлять 1/(2-10). Это обусловлено, кроме описанной выше реакции, конкурентными процессами с ОН-радикалами и более быстрыми реакциями с участием гидратированных электронов:
+БН-
СуБ + СуБ-БН —» СуБ-Н + СуБ-Э Поэтому е' ач вызывают восстанавливаемую инактивацшо, в то время как ОН-радикалы - невосстанавливаемую [73]. Увеличение величины pH облучаемого раствора папаина, как правило, повышает величину радиационно-химического выхода инактивации [74], хотя взаимосвязь этих величин однозначно не выяснялась.
Особый интерес для нас представляет влияние пероксида водорода на радиационную инактивацию папаина [77,80,24]. Оказалось, что Н2О2 дает 60% восстанавливаемых и 40% невосстанавливаемых повреждений в папаине [80].
Главное отличие в механизмах радиационной инактивации сериновых и сульфгидрильных протеиназ заключается в том, что в последнем случае наблюдается не только нарушение конформации при деструкции (модификации) ароматических аминокислотных остатков, но и конкурентный, превалирующий по вкладу, процесс одноударной инактивации за счет прямого поражения активного центра гидратированными электронами. Это увеличивает радиочувствительность сульфгидрильных ферментов и делает их сильнейшими радиопротекторами в организме.
1.1.3. Другие типы протеиназ.
Если радиолиз сериновых и сульфгидрильных протеиназ изучен достаточно подробно, то остальные представители протеиназ упоминаются в литературе по радиационной стабильности от случая к случаю.
28
Для кислой протеиназы - пепсина - содержащей в активном центре остаток аспарагиновой кислоты было показано, что при радиолизе основным инактивирующим агентом является также ОН радикал [81]. Н-атомы, хотя проявляют высокую эффективность по отношению к процессу инактивации пепсина, но вносят все же меньший вклад в этот процесс. Как и в предыдущих рассмотренных случаях инактивация фермента проходит через стадию повреждения остатков Tip и Туг. Это доказано изменением величины инактивации в присутствии ионов Вг' и (SCN)2' а также t-бутанола. На рис.2 инактивация пепсина представлена в виде дозовых зависимостей при изменении pH и в различных условиях Она имеет пик в области pH 2-3.
Для обсуждения результатов нашей работы важно обратить внимание на то, что не описано принципиальных отличий от рассмотренного выше механизма инактивации и при облучении карбоксипептидазы-А [82], хотя в этом случае активный центр фермента содержит ион цинка (как и в изучаемом нами АПФ). Величина радиационно-химического выхода инактивации этого фермента (ферментативная активность измерялась по природному субстрату - гемоглобину) имеет величины, близкие в аналогичных условиях к таковым для химотрипсина (0,44 в присутствие N20 и 0,27 в присутствие N2).
Следует обратить особое внимание на исследования
относительно описания конформационных эффектов при
термоинактивации аминоацилазы и щелочной фосфатазы [83], где дан кинетический анализ конформационного замка в их струкгурной организации. Конформационным замком называется межбелковый контакт, достигающийся при достижении
оптимального строения (плотной упаковки). Он характерен для белков с четвертичной структурой, диссоциация которых выглядет при термоинактивации как пороговый эффект. Первичный процесс диссоциации домена связывания напоминает плавление, при котором возможно скачкообразное изменение свойств домена, а обратимый процесс диссоциации относится к взаимодействию уже разрушенных (расплавленных) частей домена связывания. При этом процесс разрушения домена связывания является многостадийным и кинетическим анализом оценивается по кривой термоинакгивации число промежуточных разрушений контакта. •Для сложных ферментов, содержащих более одного домена в структуре и способных к образованию димеров и тетрамеров (как,
- Київ+380960830922