стр
4
9
9
11
12
13
18
20
23
24
24
25
27
28
29
30
32
34
37
37
38
38
42
42
42
44
2
Содержание
Введение...............................................
Обзор литературы.......................................
Введение...............................................
Определение болезни Марека, общая характеристика
возбудителя............................................
Организация генома вируса болезни Марека...............
иЬ область.............................................
ОБ область.............................................
11Ь область............................................
ЯБ область.............................................
Цикл развития вируса, и биология развития..............
Заражение в естественных условиях......................
Стадия ранней цитолитической инфекции..................
Стадия латентной инфекции..............................
Продуктивная инфекция перьевых фолликулов..............
Вакцинация.............................................
Диагностика............................................
Диагностика ВБМ путем обнаружения вирусной ДНК....
Заключение но обзору литературы........................
Собственные исследования...............................
Материалы и методы.....................................
Результаты собственных исследований....................
Разработка методов отбора, хранения биоматериала
и выделения из него ДНК для генодиагностики............
Методы индикации ВБМ методом ПЦР.......................
Методы индикации ВБМ методом ПЦР, с возможностью последующего определения генотипа, специфичного для
различных серотипов вируса, методом ПДРФ...............
Выбор последовательности для разработки ДНК............
Подбор праймероз для проведения ПЦР....................
3
2.2.2.1.3. Отработка температурных режимов ПЦР........................ 47
2.2.2.1.4. Определение серотипа ВБМ методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ампликона, полученного
при проведении ПЦР.......................................... 49
2.2.2.1.5. Чувствительность ПЦР реакции in vivo......................... 50
2.2.22. Разработка количественной ПЦР в реальном времени, с
красителем SYBR Green....................................... 51
2.2.2.2.1. Оптимизация проведения реакции............................... 52
2.2.2.2.2. Определение количества матрицы............................... 54
2.2.3. Использование методов генодиагностики для контроля
эффективности специфической профилактики БМ................. 57
2.2.3.1. Использование количественной ПЦР, на основе красителя SYBR Green, для оценки качества вакцинных препаратов
против НМ................................................... 57
2.2.3.2. Оценка качества вакцинации птиц против БМ в ПЦР............... 58
2.2.4. Использование ПЦР для оценки эффективности специфической
профилактики БМ в эпизоотических очагах, в том числе с ассоциированным течением инфекций.................. 60
2.2.4.1. Формирование выборок для лабораторных исследований в
отрасли промышленного птицеводства.......................... 60
2.2.4.2. Эффективность специфической профилактики БМ в эпизоотических очагах при ассоциированном проявлении
БМ и аденовирусного гепатита................................ 65
2.2.4.3. Влияние инфекции вирусом инфекционного ларинготрахеита на
проявление БМ............................................... 68
3. Обсуждение результатов исследований......................... 72
4. Выводы...................................................... 76
5. Практические предложения.................................... 77
6. Список литературы........................................... 78
7. Приложения................................................... 105
10
Lombardini, 1986; R.L. Witter, 1997a). Существенным обстоятельством, является нестерильность иммунитета при БМ. Вакцинация обеспечивает защиту только от клинического проявления болезни и смертности птицы, и нс препятствует заражению полевыми изолятами вируса, их репликации и выделению в окружающую среду (A. Islam et all, 2007b; K.A. Schat and C.J. Markowski-Grimsrud, 2001; V. Nair, 2004; K.A. Schat, 2004; J. Tan et all, 2007; R.L. Witter, 1983; R.L. Witter, 2006).
2. Нарушение условий хранения, разведения и применения вакцины. Некоторые исследователи ставят данный пункт на первое место, среди причин возникновения вспышек болезни у вакцинированной птицы (P.M. Коровин и Н.Д. Прибыдайло, 2001; М. Bublot and J. Sharma, 2004; С. Morrow and A. Fehler, 2004). Любое нарушение приведет к снижению количества введенного вакцинного вируса, и соответственно снижению эффективности вакцинации.
3. Нарушение условий содержания птицы. Сюда относиться не соблюдение требований к дезинфекции и подготовке помещений, нерациональное назначение фармакологических препаратов, использование низкокачественных кормов и добавок, неудовлетворительные условия содержания птицы (Р.Н. Коровин и Н.Д. Прибыдайло, 2001; М. Bublot and J. Sharma, 2004; С. Morrow and A. Fehler, 2004).
4. Использование кроссов птицы с повышенной чувствительностью к БМ. Данная проблема была особенно актуальна в средине XX века, когда производители мяса птицы делали выбор в пользу низкопродуктивных, но устойчивых к БМ кроссам кур, в ущерб высокопродуктивным кроссам. В настоящее время имеется большое количество публикаций о восприимчивости различных кроссов к БМ (L.D. Bacon et all, 2001; M.G. Emara et all, 2001; S. Weigend et all, 2001).
Все это, наряду с такой особенностью отрасли промышленного птицеводства, как содержание большого количества генетически однородных восприимчивых хозяев на ограниченной территории, позволяет ускорять естест-
11
венную эволюцию возбудителя, в сторону увеличения патогенности и вирулентности (С. Morrow and A. Fehler, 2004), что в конечном итоге приведет к появлению вирусов способных вызывать патологии у вакцинированной птицы (R.L. Witter, 1997а; SJ. Baigent, 2006b).
На этом фоне большое значение имеет не только разработка новых методов диагностики возбудителя, но и возможности их использования для прогнозирования возникновения и развития вспышек БМ. В случае вирусной инфекции наиболее оптимальными являются методы направленные на обнаружение ДНК возбудителя. Определяющими факторами при этом является выбор оптимального участка последовательности генома возбудителя, подходящей для поставленных целей и знание патогенеза инфекции, для правильного осуществления отбора биоматериала.
1.1. Определение болезни Марека, общая характеристика
возбудителя
Болезнь Марека - высококонтагиозное, хроническое заболевание птиц отряда куриные, характеризующееся развитием неопластических лимфоидных новообразований и воспалительных процессов в паренхиматозных органов, коже, нервах (Ш.К. Куляшбекова и соав 2001; N. Osterrieder et all, 2006).
Возбудителем является клеточно-связанный герпесвирус. По своим лимфотропным свойствам вирус подобен представителям подсемейства гамма- герпесвирусов, однако согласно молекулярной структуре и организации генома вирус относиться к альфа-гсрпесвирусам (B.W. Calnec and R.L. Witter, 2003). В настоящее время выделен отдельный род Mardivirus (M.H.V. van Re-genmortel et all, 2000), прототинным представителем которого является возбудитель болезни Марека - вирус болезни Марека I серотипа - ВБМ1 (A.J. Davison, et all 2006). Так же сюда относятся вирус болезни Марека И серотипа (ВБМ2, герпес вирус кур), и вирус герпеса индеек (ВГИ, или вирус болезни Марека III серотипа - ВБМЗ). Понятие «серотип» используется, поскольку
- Київ+380960830922