СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 7
ВВЕДЕНИЕ 8
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 17
ЕЕ Современная концепция использования в генетических исследованиях ДНК-маркеров: типы маркеров и области их применения 17
1.2. Анализ современной ситуации по болезням свиней и
крупного Рогатого скота, вызываемых мРНК и ДНК микроорганизмами 2! Е2.1. Классическая чума свиней и Вирусная диарея КРС 21
Е2.2. Fusobacterium necrophorum 29
Е2.2.Е Характеристика возбудителя некробактериоза 29
1.2.2.2. Морфология Fusobacterium necrophorum 31
1.2.2.4. Культуральные и биохимические свойства 34
1.2.2.4. Патогенные свойства Fusobacterium necrophorum 38
1.2.2.5. Диагностика некробактериоза 45
1.2.2.5.1. Биологический метод 45
1.2.2.5.2. Серологический метод 50
1.2.2.5.3. ДНК-технологии при изучении полиморфизма культур Fusobacterium necrophorum 54
1.2.2.5.4. Белковый полиморфизм культур Fusobacterium necrophorum 57
1.2.3. Ми ко плаз м ы 60
1.2.3.1. Краткая характеристика микоплазм 60
1.3. ДПК-маркеры в генетических исследованиях на основе ПЦР (мономорфные и полиморфные ДНК-маркеры) 66
1.3.1 Мономорфные ДНК-маркеры на основе ПЦР 66
3
1.3.2. Обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) 68
1.3.3. Гнездовая ПЦР (nested PCR) 69
1.3.4. Мультипраймерная (мультиплексная) ПЦР 70
1.3.5. Д1 IK-маркеры на основе ПЦР с праймерами, имеющие множественную локализацию в геноме 71
1.3.6. Технология подготовки и проведения полимеразной цепной реакции 73
1.3.6.1. Выделение ДНК 74
1.3.6.2. Подбор праймеров 76
1.3.6.3. Полимеразная цепная реакция. 78
1.3.6.4. Параметры температу рных циклов 80
1.6. Заключение по обзору литературы 82
2. СОБСТВЕННЫЙ ИССЛЕДОВАНИЯ 86
2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 86
2.1.1. Разработка тест-системы для EST-маркирования экспрессирующихся последовательностей мРНК генов вируса классической чумы свиней и вируса вирусной диареи крупного рогатого скота 86
2.1.2. Разработка тест-системы для STSs-маркирования нуклеотидных последовательностей Fusobacterium necrophorum. 88
2.1.3. Изучение полиморфизма ДНК культур Fusobacterium necrophorum и ДНК культур Mycoplasm. 94
2.1.4. Электрофорез продуктов ПЦР 96
2.1.5. Биологическая проба с культурами Fusobacterium necrophorum 97
2.1.6. Полиморфизм олигомеров культур Fusobacterium necrophorum 97
2.2. РЕЗУЛЬТА ТЫ ИСС'ЛЕДОВАНИЙ 99
2.2.1. мРНК и ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и области применения 99
40
J.E. Coyle-Dennis and L.H. Lauerman, 1978; C.M. Scanlan ct al., 1982, C.M. Scanlan and J.N. Berg, 1986). Действие лейкотоксина направлено против лейкоцитов, особенно полиморфоядерных клеток (D.L. Emery, J.A. Vaughan, 1986; S.К. Narayanan et al., 2002).
По данным J. N. Berg, and C.M. Scanlan(J982), C.M. Scanlan et al. (1983), L.J. Forrester et al. (1985), D. L. Emery, J. A. Vaughan, B. L. Clark, J. H. Dui'ty and
D. J. Stewart (1985), G.R. Smith (1992), G.R. Smith, Thornton, E.A. (1993), Z.L. Tan, T.G. Nagaraja, M.M. Chengappa (1996) культуры Fusubacterium necrophorum subspecies necrophorum (это биотипы A, AB) являются наиболее патогенными для белых мышей. Они не еедиментируют при росте в жидких питательных средах, гемолизируют эритроциты, агглютинируют куриные эритроциты, выделяют в культуральную жидкость экзотоксин. Fusubacterium necrophorum subspecies funduliforme (ботил В) менее патогенней, гемолизирует эритроциты, но не агглютинирует куриные эритроциты. Fusubacterium pseudonccrophorum (биотип С) не патогенен для всех видов животных и не обладает ни одним из перечисленных дифференциальных признаков.
При изучении биохимических и биологических свойств культур F. pseodonecrophorum и F. necrophorum Т. Shinjo, К. Hiraiwa и S. Miyazto (1990), L.A. Nicholson, C.J. Morrow, L.A. Corner, A.L.M. Hodgson (1994), R. Brown, H.G. Lough, I.R. Poxton, (1997) определили, что культуры разных штаммов F. necrophorum подвидов necrophorum (биотип А) и funduliforme (биотип В) дают положительную реакцию на липазу, [3-гемолизин, подвержены действию пеницилииа при концентрации 500 U/ml, вызывали патологию в виде абсцессов во внутренних органах. Различие между подвидами заключалось в том, что биотип А агглютинировал эритроциты в титрах в от 1: 4 до 1: 128, а биотип В
41
нет. У изолятов F. pseudonecrophorum на эти тесты реакция была отрицательной и были резистентны к воздействию пеницилина в тех же концентрациях.
Т. Shinjo, S. Miyazato (1981), Т. Shinjo, Н. Ha/.u, Н. Kiyoyarna (1987), Т. Shinjo, Т. Fujsawa and Т. Mitsuoka (1991) провели изучении биохимических и биологических свойств новых культур F. necrophorum подвидов necrophorum и funduliforme и установили, что F. necrophorum subsp. necrophorum агглютинирует эритроциты в разведении 1: 8 и выше и синтезирует фермент липазу, а изоляты F. necrophorum subsp. fundulifomc не синтезируют этого фермента и агглютинируют эритроциты в разведении 1: 4 и ниже.
Интересное исследование провели С. М. Scanlan, А. Н. Hoyumpa and Р. С. Ainsworth в 1992 г. и К. К. Amoako, Y.Golo и Т. Shinjo в 1993 году на предмет синтеза экстрацеллюлярных ферментов изолятами F. necrophorum subsp. necrophorum и F. necrophorum subsp. funduliforme. Тесты проводились по 13 ферментам. Ими было установлено, что культуры F. necrophorum subsp. necrophorum синтезируют гемагглютинин, фосфатазу, ДНК-азу, липазу, коллагеназу и желатиназу, а культуры F. necrophorum subsp. funduliforme только геагглютинии. Оба подвида не синтезируют р -л актом азу.
Z. L. Tan, T.G. Nagaraja и М.М. Chengappa (1994), '1'. Fifis, С. Costopoulos, J.A. Vaughan (1996) охарактеризовали в сравнительном аспекте изоляты F. necrophorum subsp. necrophorum и subsp. fundulifomc, выделенных из рубца и абсцессов печени, по 30 биохимическим и биологическим параметрам. Они определили, что изоляты обоих подвидов независимо от места выделения из организма животного продуцируют- индол, сероводород, не гидролизуют желатину, синтезируют ДНК-азу, но не синтезируют каталаз и гидролаз, разлагающих нитрофенилфосфаты, не редуцируют нитраты, обладают гемолизирующей активностью. Все изучаемые изоляты обоих подвидов
- Київ+380960830922