ОГЛАВЛЕНИЕ
1 ВВЕДЕНИЕ..........................................................3
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..................................................7
2.1 Иммуноферментный анализ и его применение в ветеринарной вирусологии..................................................7
2.2 Краткие исторические данные, распространение вирусного энтерита (парвовирусной инфекции) гусей и ущерб, причиняемый этим заболеванием.....................................................15
2.3 Характеристика семейства парвовирусов........................18
2.4 Эпизоотологические данные болезни............................22
2.5 Клинико-патоморфологические признаки.........................25
2.6 Диагностика заболевания......................................31
2.7 Профилактика и меры борьбы...................................34
3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.........................................39
3.1 Материалы и методы...........................................39
3.1.1 Очистка вируссодержащей жидкости методом гельхроматографин на макропористом стекле .......................................41
3.1.2 Выделение иммуноглобулинов..............................42
3.1.3 Получение иммунопероксидазного конъюгата................43
3.2 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ...........................51
3.2.1. Получение специфических компонентов для иммуноферментного анализа........................................................51
3.2.1.1 Получение очищенного вируса энтерита гусей..........51
3.2.1.2 Получение положительной сыворотки крови к вирусу энтерита гусей..............................................53
3.2.1.3 Получение отрицательной сыворотки крови гусей......54
3.2.1.4 Получение антивидового иммунопероксидазного конъюгата.55
3.2.2 Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления
специфических антител к парвовирусу гусей.................57
3.2.2.1 Определение сенсибилизирующих доз антигена.........58
3.2.2.2 Определение pH сорбирующего буфера.................59
3.2.2.3 Определение времени и температуры сорбции парвовирусного антигена....................................61
3.2.2.4 Определение времени и температуры инкубации сывороток с адсорбированным парвовирусным антигеном..63
3.2.2.5 Определение специфичности иммуноферментного анализа..65
3.2.2.6 Определение диагностического титра сыворотки в ИФА.67
3.2.2.7 Количественная оценка титра антител к вирусу энтерита гусей методом одного разведения............................70
3.2.3 Практическое использование разработанной тест системы на основе непрямого метода ИФА...................................77
4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ...............................86
5 ВЫВОДЫ............................................................96
6 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................98
ПРИЛОЖЕНИЕ
122
11
антиферментные антитела. Антитела к пероксидазе в настоящее время производятся рядом фирм в коммерческом масштабе (НИИЭМ им. Гамалеи).
Для достижения высокой специфичности, чувствительности, воспроизводимости, экспрессивности и автоматизации иммунохимических анализов принципиально возможным является использование только первой стадии простого иммунохимического взаимодействия. Так как процесс комплексообразования пары анализируемое соединение (антиген) — специфическое антитело происходит в строго количественном соотношении, то экспериментально устанавливаемая концентрация метки, входящей в состав образующегося иммунохимического комплекса, однозначно связана с исходной концентрацией антигена.
Для осуществления такого анализа необходимо провести эффективное разделение комплексов от свободных компонентов. Эту задачу оказалось легко решить, если один из компонентов пары антиген - антитело прочно иммобилизовать на твердом носителе. Иммобилизация позволяет предотвратить агрегацию в растворе и осуществить физическое разделение образующихся иммунных комплексов от свободных компонентов. Возможность прочного связывания на носителе антител или антигенов с сохранением их способности к специфическому образованию иммунных комплексов и разработка на этом принципе твердофазных методов дали мощный импульс для развития иммуноферментных методов анализа.
На протяжении 70-80-х годов иммуноферментные методы анализа интенсивно развивались как в теоретическом, так и практическом плане и к настоящему времени они сформировались в самостоятельное научное направление, имеющее важное прикладное значение. Использование твердых носителей для сорбционной иммобилизации антител с последующим специфическим связыванием анализируемого соединения на иммуносорбенте я выявлением образовавшихся иммунокомплексов с помощью меченых
12
ферментами компонентов положило начало методам твердофазного иммуноферментного анализа (ЕгщуаН, Рег1тапп, 1971).
Эти методы наиболее распространенные и используются для определения широкого круга, как низкомолекулярных соединений, так и высокомолекулярных соединений — антител, гормонов, вирусных и бактериальных антигенов, пестицидов.
Особую значимость для широкого внедрения ИФА в практику имела разработка в качестве носителей для сорбционной иммобилизации антител и антигенов специальных полистирольных плат, содержащих 96 лунок. Факт сорбции антител на поверхности полистирола был установлен в середине 60-х годов и использован первоначально в методах радиоиммунологического анализа (РИА) (А.М. Егоров, с соавт., 1991). За разработку метода авторы Р. Йолоу и С. Берсон в 1977 году были удостоены Нобелевской премии; Радиоиммунный метод является самым чувствительным (на уровне пкг/мл). Однако ему присущи определенные недостатки:
- ограниченный срок жизни радиоактивной метки;
- наличия дорогостоящего оборудования;
- радиационная опасность для персонала (Т. Чард, 1981).
В то время как ИФА имеет ряд преимуществ: высокая стабильность оеагентов, невысокая стоимость анализа, отсутствие отходов загрязняющих окружающую среду и не опасен для здоровья экспериментатора (СагПеэ е1 а1., 1981). Введение в практику ИФА полистироловых планшет позволило значительно увеличить число проводимых анализов и упростить методическую процедуру его выполнения. Были сконструированы специальные приборы, позволяющие автоматизировать постановку реакции и осуществлять одновременную регистрацию каталитической активности фермента - метки в каждой из лунок полистиролового планшета. ИФА допускает и визуальную оценку результатов, а эта делает его доступным для обычных практических лабораторий. Эти достоинства позволили ИФА занять
- Київ+380960830922