РОЗДІЛ 2
МАРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Лабораторні тварини та моделювання експерименту
Експериментальні дослідження проведенні на 480 щурах різного віку та 30 зародках щурів лінії Вістар. Усі тварини утримувалися за стандартних умов віварію ?65?. Дослідження планували враховуючи основні положення моделювання експериментів по вивченню спадкових радіаційних ефектів у ссавців ?91?. У відповідності до мети та задач дослідження всі експериментальні тварини були поділені на наступні групи:
- інтактні статевозрілі самці і самки;
- статевозрілі самці і самки, опроміненні у сумарній дозі 0,75 Гр;
- статевозрілі самці і самки, опроміненні у сумарній дозі 1,0 Гр;
- 18-денні зародки; дводенні, 14-денні щурята, отримані від інтактних щурів;
- 18-денні зародки; дводенні, 14-денні щурята, отримані від опромінених у сумарній дозі 0,75 Гр самців і самок;
- 18-денні зародки; дводенні, 14-денні щурята, отримані від опромінених у сумарній дозі 1,0 Гр самців і самок;
- самці і самки віком 30, 45, 90 та 365 діб, отримані від інтактних щурів;
- самці і самки віком 30, 45, 90 та 365 діб, отримані від щурів, опромінених у сумарній дозі 0,75 Гр;
- самці і самки віком 30, 45, 90 та 365 діб, отримані від щурів, опромінених у сумарній дозі 1,0 Гр.
Групи тварин, що підлягали опроміненню формували із здорових статевозрілих самців та самок віком три місяці та вагою 180-200 г. Самок відбирали таким чином, щоб вони знаходились на одній стадії естрального циклу, останню визначали за допомогою мазків з піхви [109].
Експериментальних тварин піддавали тотальному ?-опроміненню на гаматерапевтичній установці АГАТ-Р № 83 (ізотоп 60Со). Опромінення проводили натщесерце о 9-й годині ранку, при слідуючих технічних умовах: потужність дози 107 рад/хв, відстань від джерела до поля 0,75 м; розміри поля 0,2 ? 0,2 м; одноразово по 0,15 Гр (експозиція вісім секунд) та 0,1 Гр (експозиція шість секунд) кожні 72 години до досягнення сумарної дози 0,75 та 1,0 Гр відповідно. Під час опромінення тварини знаходилися у спеціально виготовлених клітках-фіксаторах з органічного скла. Дозиметричний контроль проводився дозиметричною службою Одеського онкологічного диспансеру, на базі якого проводили опромінення.
З метою отримання виводку від радіаційноуражених попередників, через 12 діб по завершені дії іонізуючої радіації проводили спарювання самців і самок, опромінених як у дозі 0,75 Гр так і у дозі 1,0 Гр. Відбір самок для запліднення та визначення першого дня вагітності проводили за методиками отримання тварин з точно датованим строком вагітності ?109?. До експерименту брали 18-денних зародків, щурят віком 2, 14, 30, 45, 90, 365 діб, отриманих від інтактних та опромінених самців і самок.
Для визначення особливостей тіол-дисульфідного обміну у опромінених у дозі 0,75 і 1,0 Гр статевозрілих щурів, частину тварин брали до експерименту на 12-ту добу після завершення опромінення.
2.1. Методи досліджень
Щурів забивали шляхом швидкої декапітації ?6?. Одразу вилучали печінку, промивали охолодженим до +4?С фізіологічним розчином, та готували з неї наважку тканин печінки на торзіоних терезах. Тканини печінки гомогенізували у скляному гомогенізаторі з тефлоновим пестиком за допомогою мікророзмільчувача тканин РТ-2, на протязі 1 хвилини при 5000 обертах на хвилину. Середовище виділення: ТРИС-буфер рН 9,5 у співвідношенні 1 г тканин печінки - 10 мл буферного розчину. Отриманий гомогенат центрифугували 15 хвилин при 3000 обертах на хвилину для отримання супернатанту.
Кров у щурів забирали після декапітації. Отримували сироватку крові за стандартною методикою ?24?. Сироватку крові не досліджували у зародків та щурят віком дві доби у зв'язку з малим об'ємом крові і неможливістю отримати достатню кількість сироватки. З аналогічної причини не досліджували вміст небілкових сульфгідрильних груп у сироватці крові 14-денних щурят.
У супернатанті та сироватці крові визначали кількість Аg+-чутливих сульфгідрильних і дисульфідних груп білкового походження та сульфгідрильних груп небілкового походження методом зворотнього амперометричного титрування ?24, 122?, за допомогою приладу для амперометричного титрування (виробництво "Химлаборприбор" ТУ 25-11-364-69, СРСР).
Принцип методу полягає у слідуючому. До кювети для титрування додають трис-буфер (трис-гідроксиметил-амінометан) і додають розчин AgNO3 Внаслідок цього в електричній схемі установки, яка складається із занурених в кювету для титрування індикаторного платинового електрода і каломельного електрода порівняння, виникає дифузний струм як результат відновлення іонів срібла на платиновому індикаторному електроді. Величину струму контролюють за допомогою мікроамперметра. Приріст струму відбувається пропорційно доданому розчину AgNO3. Потім у кювету для титрування вносять біоматеріал. Іони срібла зв'язуються SH-групами з утворенням стійкого меркаптиду, у результаті чого відбіувається пропорційне зниження величини вихідного дифузного струму. Кількість Ag+ -чутливих SH-груп у біоматеріалі еквівалентна кількості зв'язаних іонів срібла, яку розраховували за формулами ?24, 122?. Для цього використовували ЕОМ "Pentium 200".
Визначення вмісту дисульфідних групп проводили методом зворотнього амперометричного титрування ?119, 122?. Принцип методу полягає у слідуючому. Титрування проводиться аналогічно вищезгаданому, але у присутності надлишку іонів срібла. Після визначення кількості Ag+-чутливих SH-груп у біоматеріалі в кювету для титрування вносять сульфіт натрію (Na2SО3), який відновлює дисульфідні зв'язки і знову утворені сульфгідрильні групи реагують з іонами срібла, у результаті чого відбувається пропорційне зниження величини вихідного дифузного струму. Кількість SS-груп у біоматеріалі еквівалентна кількості зв'язаних іонів срібла після додавання до реакційної суміші сульфіту натрію. Розрахунки вели за формулами ?24, 122? з використанням ЕОМ "Pentium 200".
SH ? SS-коефіцієнт (тіол-дисульфідне співвідношення, редокс-потенціал) білкових молекул
- Київ+380960830922