ГЛАВА 2
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБСЛЕДОВАННЫХ БОЛЬНЫХ
2.1 Методы исследования
В исследование включено 100 человек: 80 больных с мягкой или умеренно
выраженной ЭАГ и 20 пациентов с нормальным уровнем АД, составивших контрольную
группу.
Диагноз ЭАГ ставили методом исключения вторичных форм АГ на основании данных
анамнеза, клинических, лабораторных и инструментальных методов исследования.
Течение АГ оценивали по уровню АД согласно рекомендациям ВОЗ (1999): к мягкой
АГ относили пациентов с САД 140-159 мм рт. ст. и/или ДАД 90-99 мм рт. ст., к
умеренной – больных с САД 160-179 мм рт. ст. и/или ДАД 100-109 мм рт. ст. В
исследование включали пациентов, у которых на фоне 2-х недельной отмены всех
антигипертензивных препаратов среднее офисное АД, измеренное в положении сидя в
первой половине дня, было 140/90 мм рт. ст. и выше.
Не включали в исследование больных с заболеваниями печени и почек в стадии
декомпенсации, сердечной недостаточностью Ш-IV функционального класса (по
классификации Нью-Йоркской ассоциации сердца), перенесенным в пределах 6
месяцев инфарктом миокарда или острым нарушением мозгового кровообращения,
сахарным диабетом в стадии декомпенсации или плохо контролируемым, после
хирургических вмешательств, с уровнем офисного САД 180 мм рт. ст. и выше или
ДАД 110 мм рт. ст. и выше, с выраженными ментальными нарушениями.
Первый этап исследования включал:
- измерение среднего офисного АД трехкратно, с 2-минутным интервалом в
положении сидя, в первой половине дня стандартным сфигмоманометром;
- комплекс лабораторных клинико-биохимических методов исследования: клинические
анализы крови и мочи, биохимический анализ крови с определением содержания
электролитов (К+, Na+) в эритроцитах и плазме, липидного спектра; уровень
гликемии натощак, активность АПФ в плазме;
- определение ПВЧ к соли;
- инструментальные методы исследования: ЭКГ, ЭХОКГ, рентгенография органов
грудной клетки;
- определение полиморфизма гена АПФ.
После проведения основных клинических, лабораторных и инструментальных методов
исследования всем пациентам предлагали диету № 10 по Певзнеру с содержанием
поваренной соли – 2 г и ограничением жидкости до 1,5 л в сутки на протяжении 7
дней, после чего измеряли офисное АД и проводили СМАД.
Забор крови для лабораторных биохимических исследований осуществляли утром,
натощак из локтевой вены силиконовой иглой, самотеком, в силиконовые пробирки с
внесенными заранее реактивами.
Для исследования липидного спектра кровь брали в пробирки с
этилендиаминтетрауксусной кислотой – ЭДТА: 1 мг сухой динатриевой соли на 1 мл
крови. Пробы центрифугировали при 4000 об/мин в течение 20 минут. Плазму
отбирали из верхнего слоя, не касаясь тромбоцитарного и лейкоцитарного слоев.
В плазме определяли общий холестерин (ОХС), триглицериды (ТГ) и
холестеринлипопротеиды высокой плотности (ХСЛПВП) ферментативным методом на
автоанализаторе Stat Fax 1904 plus (США).
Содержание холестеринлипопротеидов низкой плотности (ХСЛПНП) рассчитывали по
формуле Friedwald:
ХСЛПНП = ОХС – (ХСЛПВП + ТГ/5).
коэффициент атерогенности (КА) – по формуле А. Н. Климова:
КА = (ОХС – ХСЛПВП)/ХСЛПВП.
За верхние границы нормы принимали: ОХС – 5,2 ммоль/л, ТГ – 1,65 ммоль/л, КА –
3. Нижней границей нормы ХСЛПВП считали 0,9 ммоль/л.
Типирование дислипопротеидемий (ДЛП) было проведено согласно системе,
предложенной Fredrickson и одобренной экспертами ВОЗ [129] .
Содержание К+, Na+ в эритроцитах определяли унифицированным методом фотометрии
пламени. За нормальные величины принимали: К+ – 77-96 ммоль/л, Nа+ – 13-22
ммоль/л.
Содержание Nа+ в сыворотке крови определяли с помощью фотометрического,
Mg-уранилацетатного колориметрического теста. За нормальные величины принимали
содержание Nа+ в сыворотке – 130-150 ммоль/л.
Содержание К+ в плазме определяли фотометрическим турбидиметрическим методом.
Нормальными значениями содержания калия в сыворотке крови считали 3,6-5,5
ммоль/л.
Ядра из клеток крови выделяли смешиванием аликвоты крови с 4-х кратным объемом
лизирующего сахарозного буфера CLB (0,32 М сахароза, 10 мМ трис-HCl, рН-7,6; 5
мМ MgCl; 1 % тритон-Х-100). Время инкубации составляло 10 минут. Лизат
центрифугировали 5 минут при 4°С (900g).
CLB: 0,32 М сахароза – 109,44 г (м.в. 34)
10 мМ трис-HCl – 1,211 г (м.в. 121,1)
5мМ MgCl – 20,475 г (м.в. 95)
1 % тритон Х-100.
Осадок с ядрами отмывали CLB. Центрифугировали 10 минут при 1500g. Ядра
ресуспендировали в ледяном PLB (10 мМ трис-HCl рН – 8,0; 10 мМ NaCl, 10 мМ
ЭДТА) с добавлением додецилсульфата натрия (до 1%). Смесь инкубировали в
течение 2 часов при t° - 65°С, периодически встряхивая. Хранили при - 20°С.
Выделение ядерной ДНК из раствора нуклеиновых кислот проводили стандартным
способом – однократной экстракцией вначале фенолом, затем смесью фенола и
хлороформа (1:1) и, наконец, хлороформом. Перед применением фенол плавили при
68°С и добавляли 8-оксихинолин (Serva), который является антиоксидантом, до
конечной концентрации 0,1 %. Расплавленный фенол несколько раз насыщали равным
объемом буфера (1,0 М трис-HCl, рН-8,0, затем 0,1 М трис-HCl, рН-8,0 и 0,2 %
в-меркаптоэтанола) до тех пор, пока рН водной фазы не станет больше 7,6.
Смешивали пробу, содержащую ДНК с равным объемом фенола или смеси фенола с
хлороформом до образования эмульсии, затем центрифугировали 3 минуты (1600g)
при комнатной температуре для разделения органической и водной фазы. Верхний
водный слой переносили пипеткой в полипропиленовую пробирку, добавляли смесь
фенола и хлороформа, вновь центрифугировали 3 минуты при комнатной
температуре.
После последней экстракции хлороформом
- Київ+380960830922