РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Штами бактерій
Об'єктами дослідження були два штами фітопатогенних бактерій, які належать до двох патоварів:
* Pseudomonas syringae pv. atrofaciens (McCulloch 1920) Young, Dye & Wilkie 1978 штам 8281 (УКМ В-1013), який є збудником бактеріальної плямистості жита в Україні [69]. Штам P. syringae pv. atrofaciens 8281 був ізольований із сухої луски верхньої частини колосу жита сорту Харківське 60 (Житомирська обл., Малинський ДСУ).
* Pseudomonas syringae pv. coronafaciens (Elliott 1920) Young, Dye & Wilkie 1978 штам 9030. Цей патовар є основним небезпечним збудником ореольного бактеріозу вівса в Україні [157]. Штам P. syringae pv. coronafaciens 9030 був ізольований з ураженого листка вівса сорту Грач в Україні (Черкаська обл., Маньківський ДСУ).
В роботі також використано типовий штам Pseudomonas syringae pv. syringae 8511 (NCPPB 281, ATCC 19310, УКМ B-1027).
Для індукції пухлиноутворення було використано штами Agrobacterium tumefaciens (Smith ? Townsend 1907) Conn 1942, які зберігаються в колекції живих культур відділу фітопатогенних бактерій Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (табл. 2.1).
Таблиця 2.1
Характеристика використаних в роботі штамів Agrobacterium tumefaciens
Вид та номер штамуДжерело виділенняЗвідки отриманий штамA. tumefaciens 9047 ? ATCC 23308 ? NCPPB 943 ? УКМ В-1003 (типовий штам, B6 біовар 1)Яблуня, корончатий галІн-т молекулярної біології і генетики НАН України, КиївA. tumefaciens 8465ВиноградІн-т мікробіології, ЄреванA. tumefaciens 8466ВиноградІн-т мікробіології, ЄреванA. tumefaciens 8459ВиноградІн-т виноградарства, виноробства та плодівництва, ЄреванA. tumefaciens 8999 ? CCM 2835?Чехословацька колекція мікроорганізмів, БрноA. tumefaciens 9053Корені хризантемиІн-т мікробіології і вірусології НАНУ, КиївA. tumefaciens 9052Корені хризантемиІн-т мікробіології і вірусології НАНУ, КиївA. tumefaciens 9054ВиноградНДІ виноградарства, КишинівA. tumefaciens 8996 ? CCM 1000?Чехословацька колекція мікроорганізмів, БрноA. tumefaciens 8628 ? NCPPB 3787 ?Московське відділення НДІ сільськогосподарської мікробіології, Москва
Примітки: "?" - дані відсутні
УКМ ? Українська колекція мікроорганізмів; ATCC ? Американська колекція типових культур; CCM ? Чехословацька колекція мікроорганізмів; NCPPB ? Національна колекція фітопатогенних бактерій, Англія.
2. 2. Вивчення фізіолого-біохімічних властивостей та культивування бактерій
Культуральні, фізіологічні та серологічні властивості бактерій вивчали загальноприйнятими методами [8, 132]. Антисироватки до штамів P. syringae, які належать до різних серогруп, було надано с.н.с., к.б.н. Пасічник Л.А. Морфологію клітин і колоній спостерігали на картопляному агарі (КА). Здатність використовувати окремі вуглеводи як єдине джерело вуглецевого живлення досліджували на середовищах Омелянського та Гіса з водним розчином індикатора бромтимол синій. В якості джерел вуглецю випробували 0,1% розчини вуглеводів: моносахаридів - арабінози, глюкози, галактози, ксилози, манози, рамнози; дисахаридів - мальтози, сахарози, лактози, рафінози, целобіози; багатоатомних спиртів - гліцерину, інозиту, дульциту, маніту, сорбіту; глюкозидів - саліцину. Про засвоєння вуглеводів судили за зміною кольору індикатора, яка відбувається внаслідок зміни величини pH.
Здатність бактерій утворювати індол та сірководень вивчали на м'ясо-пептонному бульйоні (МПБ). Утворення індолу визначали за порозовінням змоченого в насиченому розчині щавлевої кислоти фільтрувального паперу. Про утворення сірководню свідчило почорніння фільтрувального паперу, змоченого в розчині оцтовокислого свинцю.
Оксидазну активність визначали методом N. Kovacs [135]. Для цього клітини досліджуваних бактерій наносили на фільтрувальний папір, змочений 1%-м розчином диметил-М-фенілендіаміносолянокислого. Через 5 - 10 с оксидазопозитивні бактерії забарвлюються в темно-червоний колір.
Патогенні властивості досліджуваних штамів в польових умовах вивчали шляхом штучного зараження рослин в фазу трубкування. В стебло рослини вводили 0,1 мл бактеріальної суспензії титром 109 кл/мл. В умовах теплиці проводили зараження сходів пшениці уколом крізь краплину бактеріальної суспензії. Про вірулентні властивості свідчив розвиток видимих ознак ураження. Реакцію надчутливості проводили на листках тютюну за методом Z.Klement [131].
Для дослідження антимутагенної і протипухлинної активності культуральної рідини та клітин досліджуваних патоварів P. syringae бактерії вирощували на картопляному бульйоні (КБ) протягом 24 год при 28?С на качалках за 240 об/хв. Клітини бактерій осаджували центрифугуванням (5000 об/хв протягом 30 хв при температурі 5?С).
Вільну від бактеріальних клітин культуральну рідину стерилізували за допомогою азбестових фільтрів. Фільтрат перевіряли на стерильність висівом на КА. Стерильний фільтрат культуральної рідини зберігали в холодильнику протягом двох - трьох днів і використовували для дослідження геномоделювальної і протипухлинної активності.
Одержані осадженням клітини P. syringae руйнували з використанням ультразвукового низькочастотного диспергатора УЗДИ-1 з трубчатим концентратором 15 кгц для опромінення протягом 6 хв. Повноту дезинтеграції клітин визначали висівом на КА. Залишки клітинних стінок видаляли центрифугуванням протягом 40хв при 2000 об/хв. Надосадову рідину використовували для дослідження.
2.3. Вивчення взаємовідносин між бактеріями
Взаємодію між досліджуваними штамами патоварів P. syringae та A. tumefaciens і S. typhimurium, які використали як тест-штами, вивчали методом відстроченого антагонізму [35]. Для цього на поживне середовище (картопляний чи м'ясо-пептонний агар) в чашці Петрі смугою по діаметру висівали бактерії, антагоністичну активність яких вивчали. Штами фітопатогенних бактерій культивували при 28?С,