ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы исследования содержатся в рамках его объекта и предмета. Аминосахар D-(+)-глюкозамин гидрохлорид (ГА*НCl), производные глюкозамина (ГА) и фенилантраниловых (ФенилАК), дикарбоновых кислот. Мягкая лекарственная форма (крем) одного из наиболее эффективных производных - глюкозиламмонийной соли этилового эфира 4-карбэтоксиоксанилоилгидразида щавелевой кислоты (оксаглюкамин - ОГА), белые нелинейные мыши, белые нелинейные крысы, морские свинки светлой масти, кролики породы Шиншилла.
Нами изучено 21 соединение: D-(+)-глюкозамин гидрохлорид, 14 его производных ? 2-D-(+)-глюкозиламмониевые соли N-фенилантраниловых кислот и 2-D-(+)-глюкозиламмониевые соли этиловых эфиров N-R-оксамоилгидразидов дикарбоновых кислот, 6 фенилантраниловых кислот, не содержащих в своей структуре аминосахара ГА.
D-(+)-глюкозамин гидрохлорид (2-дезокси-2-амино-D-глюкозы гидрохлорид) - белый кристаллический порошок без запаха, сладковато-соленого вкуса, легко растворим в воде, мало растворим в 96 % спирте, практически нерастворим в эфире, хлороформе.
Вышеуказанные субстанции синтезированы на кафедре фармацевтической химии Национального фармацевтического университета профессором А.И. Павлиём и доцентом С.Г. Исаевым.
Изучаемые вещества являются кристаллическими соединениями, большинство из которых растворимы в воде.
Наиболее активная субстанция ? глюкозиламмониевая соль этилового эфира 4-карбэтоксиоксанилоилгидразида щавелевой кислоты, отобранная на этапе фармакологического скрининга, была использована для разработки мягкой лекарственной формы для наружного применения в виде кремов различных концентраций.
Глюкозиламмониевая соль этилового эфира 4-карбэтоксиоксанилоил-гидразида щавелевой кислоты - мелкокристаллическое вещество белого цвета с кремовым оттенком, практически нерастворима в воде, малорастворимая в 95 % этаноле, мало растворима в диметилформамиде и уксусной кислоте, представлена формулой:
В Государственном научном центре лекарственных средств (ГНЦЛС, г. Харьков) в лаборатории жидких и мягких лекарственных форм профессором Н.А. Ляпуновым разработаны 1 % и 3 % кремы ОГА. Наиболее фармакологически активный 1 % крем ОГА представлен следующим составом:
Глюкозиламмонийная соль этилового эфира 4-карбэтоксиоксанилоилгидразида
щавелевой кислоты 1,0
Пропиленгликоль 45,0
Проксанол 21,0
Полиэтиленоксид (ПЭО)-400 30,0
Препарат ОС - 20 0,9
Спирты высших жирных фракций С(16) - С(20) 2,1.
В исследованиях использовано: 1077 белых нелинейных мышей массой 18-22 г, 285 белых нелинейных крыс массой 180-220 г, 134 морских свинок массой 650-750 г, 3 кролика массой 1,6-1,9 кг. Животных содержали в виварии Национального фармацевтического университета в стандартных условиях светового и пищевого режимов [37]. Состояние животных контролировали по следующим критериям: активность поведения, гладкая блестящая шерсть и чистые кожные покровы, отсутствие внешних признаков заболевания. Общее количество животных и их распределение по сериям исследований представлено в таблице 2.1.
Работу с животными проводили в соответствии с Международными требованиями о гуманном обращении к животным и с соблюдением требований Директивы 86/609/ЕЕС по вопросам защиты животных.
Начинали эксперименты в утренние часы не позднее 11 ч. Все хирургические манипуляции проводили под барбамиловым наркозом (1 % раствор 7 мл/кг массы животного) с соблюдением правил асептики. Забой животных производили путем дислоцирования или передозировки эфирного наркоза.
М е т о д ы и с с л е д о в а н и я. Для достижения цели диссертационной работы и решения поставленных задач применяли фармакологические, токсикологические, цитологические, биохимические, гистологические, гистохимические и статистические методы исследований.
При поиске противовоспалительных средств одним из характерных и определяющих критериев эффективности является антиэкссудативное действие. В связи с этим скрининг соединений с предполагаемой противовоспалительной активностью мы начинали с исследования их влияния на экссудативную фазу острого асептического воспаления. Для этого использовали метод каррагенинового отека у мышей массой 18-22 г [138].
Изучаемые соединения вводили перорально в объеме 0,3 мл на животнoe. Вещества растворяли в дистиллированной воде, а нерастворимые вводили в виде тонкодиспергированных суспензий, стабилизированных эмульгатором твинoм-80. Субстанции вводили в диапазоне доз от 5 до 20 мг/кг, так как соединения, обладающие противовоспалительной активностью в больших дозах, не являются перспективными для создании на их основе лекарственных средств [46, 109]. ГА*НCl
Таблица 2.1
Распределение животных по сериям экспериментов
ИсследованиеВидКоличество
Изучение зависимости "структура-токсич-ность-действие" противовоспалительного и репаративного действия и острой токсичности в ряду производных D-(+)-глюкозами-на. Изучение кожно-резорбтивного, возможного кожно-раздражающего и аллергизирующего действия отобранного на тапе скрининга вещества
мыши
крысы
морские
свинки1017
125
27
Проведение скринингового исследования на выявления оптимальной мягкой лекарственной формы. Изучение зависимости "структура-действие" мягких лекарственных форм на течение экспериментальных патологий кожных повреждений
мыши
крысы
60
135
Проведение цитологических, биохимических, гистохимических, гистологических исследований кожи животных с целью изучения механизмов репаративного действия крема глюкозиламмонийной соли этилового эфира 4-карбэтоксиоксанилоилгидразида щавелевой кислоты при кожных повреждениях
морские
свинки
80Изучение аллергизирующего, местнораздражающего действия крема ОГА на кожный покров
крысы
морские
свинки
кролики
16
27
3
вводили в дозе 50 мг/кг, что соответствует ДE50 по данным [38, 39] и с