РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали:
Історії хвороб
В клініці ІЕІХ ім. Л.В.Громашевського АМН України були отримані історії хвороб ВІЛ-інфікованих пацієнтів з різною тривалістю інфікування, які перебували на диспансерному обліку у відділенні СНІДу. Досліджувану групу склали пацієнти з високим ризиком розвитку опортуністичних інфекцій, оскільки кількість CD4+ лімфоцитів в них не перевищувала 500 кл/мкл.
Для визначення характеру розповсюдження та проявів ВІЛ-інфекції в групах ризику, проаналізовано 227 історій хвороб ВІЛ-інфікованих пацієнтів з різними шляхами інфікування (121 - з парентеральним, 106 - із статевим шляхом). Результати узагальнені, розраховані статистичні показники.
Анкети ВІЛ-інфікованих осіб
Нами, сумісно з вірусологічним відділом Регіонального науково-дослідного центру ВООЗ (м. Каїр, Єгипет), були розроблені анкети, за якими проводилось опитування ВІЛ-інфікованих осіб. Анкети підтверджували добровільну участь ВІЛ-інфікованих осіб в дослідженнях та вміщували важливу епідеміологічну інформацію.
Для виявлення особливостей поширення ВІЛ-інфекції в різних областях України, проаналізовано 304 анкети, отримані від ВІЛ-інфікованих осіб з різними шляхами передачі інфекції (168 - з парентеральним, 136 - із статевим шляхом), мешканців регіонів з високими та середніми показниками розповсюдженості ВІЛ.
Плазми крові
Забір крові у ВІЛ-інфікованих осіб проводили натощак із периферичної вени одноразовою голкою (діаметр 0,8-1,1 мм) в спеціальну вакуумну систему типу "Venoject" (з 6% ЕДТА), або "Vacuett(r)" (з 6% ЕДТА) у співвідношенні ЕДТА до крові як 1:20. Під час забору пробку "Vacuett(r)" проколювали спеціальною насадкою з голкою, завдяки чому кров в стерильних умовах потрапляла до вакуумної системи, яка вміщувала антикоагулянт. Для отримання плазми закриту пробірку з цільною кров'ю та коагулянтом перевертали 3-4 рази, потім - центрифугували при 800-1600 об./хв. протягом 20 хвилин при кімнатній температурі. Плазму, кількістю не менш 1 мл, відбирали окремими кінцівками з аерозольним бар'єром в одноразові стерильні пробірки системи "vacutainer", об'ємом 1,5 мл. В разі, коли матеріал планувалось заморозити, зразки плазми розділяли на аліквоти (по 0,1-0,2 мл кожна) в окремі одноразові стерильні пробірки системи "vacutainer", об'ємом 1,5 мл. Зразки плазми в пробірках "vacutainer" зберігали при температурі мінус 700С (до використання). Дозволялось тільки однократне заморожування - відтаювання.
Отриману плазму використовували для визначення рівня вірусного навантаження ВІЛ-1 та частоти реплікативної активності збудників опортуністичних інфекцій (вірусу простого герпесу 1 та 2 типу, цитомегаловірусу, вірусу Епштейна-Барр) і вірусних гепатитів (С і В) у ВІЛ-інфікованих осіб з різних груп ризику.
Визначено рівень вірусного навантаження (як показнику стану ВІЛ-інфікованих пацієнтів) в зразках крові 58 пацієнтів.
Досліджено 383 плазми крові від ВІЛ-інфікованих пацієнтів в I-ій клінічній стадії, 63 - від осіб в I-ій та IV-ій клінічних стадіях, інфікованих парентеральним та статевим шляхами, на наявність реплікативної активності збудників опортуністичних інфекцій і вірусних гепатитів.
Сироватки крові
Забір сироваток крові у ВІЛ-інфікованих осіб проводили із периферичної вени, натощак, за стандартною методикою [53,54]. З отриманих зразків сироваток готували аліквоти (по 0,25 мл кожна) та зберігали при мінус 700С (до використання).
Зразки сироваток крові використовували для проведення серотипування ВІЛ-1. Серотип ВІЛ-1 визначено в 300 зразках сироваток крові ВІЛ-інфікованих пацієнтів із парентеральним (180 зразків) та статевим (120 зразків) шляхами інфікування.
Лімфоцити (мононуклеари) периферичної крові
Забір крові у ВІЛ-інфікованих осіб проводили із периферичної вени, натощак, з використанням стерильних одноразових пробірок Becton Dickinson's VACUTAINER(r) CPTTM Cell Preparation Tube, що вміщували цитрат натрію в якості антикоагулянту. Закриті пробірки з відібраною кров'ю акуратно перевертали 8-10 разів для перемішування цільної крові з антикоагулянтом та центрифугували на центрифузі з горизонтальним ротором при 2000 об/хв. протягом 30 хвилин. Мононуклеарні клітини переносили в стерильні пробірки системи "vacutainer", об'ємом 1,5 мл та двічі відмивали фосфатно-сольовим буфером PBS (Phosphate Buffered Saline), який не вміщував Ca++ або Mg++. Після цього мононуклеарні клітини заливали 1 мл абсолютного етанолу та зберігали в умовах холодильнику при +40С (до використання).
Проведено генотипування ВІЛ-1 в 304 зразках крові, отриманих від осіб, інфікованих на різних етапах розвитку епідемії ВІЛ-інфекції/СНІДу, із парентеральним (168 зразків) та статевим (136 зразків) шляхами інфікування.
2.2. Методи:
2.2.1. Епідеміологічний аналіз
Досліджено аналітичні матеріали щодо розвитку пандемії ВІЛ-інфекції/СНІДу в світі (6 Глобальних оглядів за 1999-2004 рр.) та статистична документація щодо захворюваності на ВІЛ-інфекцію/СНІД в Україні за 1987-2004 рр. Проаналізовано 68 звітних форм №1-СНІД (квартальна), 18 звітних форм №2-СНІД (річна) державної статистичної звітності, затверджені Міністерством статистики України від 10.10.95 (Наказ №257). Проведено аналіз зведених звітів УкрЦентрСНІДу щодо захворюваності на ВІЛ-інфекцію/СНІД за 1987-2004 рр. (всього 18 річних звітів).
Результати аналізу тенденцій розвитку епідемічного процесу ВІЛ-інфекції в цілому по Україні та в окремих її областях узагальнені, підраховані статистичні показники.
2.2.2. Статистичний аналіз
За даними статистичної документації розраховувались інтенсивні показники поширеності ВІЛ-інфекції (кумулятивний показник загальної кількості випадків на 100 тис. населення) та розповсюдженості ВІЛ (кількість нових випадків на 100 тисяч населення та у відсотках).
За допомогою комп'ютерної програми Microsoft Excel, дані систематизовано у вигляді гістограм, кругових діаграм, графіків, таблиць.