ГЛАВА 2
ОБОСНОВАНИЕ НАПРАВЛЕНИЯ, Объект и методы исследования
2.1. Обоснование программы исследований и принципы формирования групп.
Планирование программы исследований, формирование групп было осуществлено в
соответствии с современными требованиями клинической эпидемиологии по единым
стандартам [83]. Выбор метода исследования, обеспечение достоверности и
обобщение результатов планируемого исследования было осуществлено с
минимизацией случайных ошибок. Кроме того, при проведении исследований мы
ориентировались на международные требования: кодекс медицинской этики,
этические требования при исследованиях, касающихся детей, международные
требования этического анализа эпидемиологических исследований [23, 51, 83].
Для достижения поставленной цели и решения задач было проведено наблюдение за
98 доношенными новорожденными, которые поступили в отделение патологии
новорожденных Полтавской детской городской клинической больницы за период с
2002 по 2005 год. Основным критерием включения в основную группу наблюдаемых
детей было наличие у ребенка при поступлении в отделение негемолитической
гипербилирубинемии. В основную группу вошли 78 доношенных новорожденных с
выраженным синдромом гипербилирубинемии, группу сравнения составили 20
доношенных детей без признаков желтухи при поступлении в отделение. Основным
диагнозом при поступлении в отделение у большинства детей основной группы и
группы сравнения был: гипоксическое поражение центральной нервной системы. У
детей с гипербилирубинемией сопутствующим диагнозом была конъюгационная
желтуха.
Рис. 2.1. Принцип формирования групп.
Определение при поступлении в отделение патологии новорожденных (7–10 сутки
жизни) у всех наблюдаемых детей наличия инфицированности вирусами герпеса 1-го
и 2-го типа, цитомегаловирусами, вирусами Эпштейн-Барр и гепатита В и С методом
ПЦР крови показало следующие результаты: у 25 детей основной группы выявлена
положительная ПЦР на ВПГ-1, у 2 детей – положительная ПЦР только на ЦМВ и у
двух – положительная на ЦМВ и ВПГ-1. Всего инфицированность на вирусы семейства
Herpesviridae выявлена у 27 детей основной группы. У одного ребенка была
положительной ПЦР на вирус гепатита С, данный ребенок был исключен из группы
наблюдения. На вирус Эпштейна-Барр у всех наблюдаемых детей ПЦР была
отрицательной.
Учитывая полученные данные о наличии инфицированности, наблюдаемые дети
разделялись на следующие группы: 1-я группа (27 детей) – с положительной ПЦР на
вирусы семейства Herpesviridae, 2-я группа (51 ребенок) – с отрицательной ПЦР
на указанные выше вирусы (инфицированности не выявлено). В группу сравнения
вошли дети с отрицательными показателями ПЦР крови на наличие изучаемых вирусов
(инфицированности не выявлено).
Для изучения результатов проводимой терапии среди детей основной группы были
сформированы две подгруппы, куда вошли как с положительной так и с
отрицательной ПЦР на вирусы семейства Herpesviridae: в 1-ю вошло 38 детей, из
них 13 – с положительной ПЦР и 15 – с отрицательной. Эти дети получали комплекс
энтеросгеля с желчегонными препаратами и пробиотиками. 2-ю подгруппу составили
36 детей, из них 12 – с положительной ПЦР и 14 – с отрицательной. Дети данной
подгруппы получали стандартную терапию: инфузию 5% глюкозы, эссенциале,
желчегонные препараты, пробиотики. Всем детям с синдромом гипербилирубинемии
проводилась фототерапия. У всех новорожденных оценивали результаты стандартных
и дополнительных методов исследований, включая рентгенографию органов грудной
клетки, нейросонографию, эхокардиографию, электрокардиографию, общие анализы
крови и мочи, биохимические показатели сыворотки крови, а также стандартные
бактериологические исследования.
2.2. Клинико-лабораторные методы исследования и их обоснование.
Руководство медицинского учреждения и матери обследованных детей были полностью
информированы относительно цели нашего исследования. Все дали согласие на
проведение исследования, которое было одобрено локальным комитетом этики
Высшего государственного учебного заведения «Украинская медицинская
стоматологическая академия» и было выполнено в соответствии с принципами
Хельсинского соглашения, подписанного в Венеции в 1983.
Базовым исследованием работы было определено изучение состояния гепатобилиарной
системы у детей основной группы, имеющих негемолитическую гипербилирубинемию в
неонатальном периоде, с учетом наличия внутриутробной инфицированности
вирусами, тропными к печеночным клеткам, а также у детей группы сравнения,
которые поступили в отделение без признаков гипербилирубинемии.
Внутриутробную инфицированность определяли методом полимеразной цепной реакции
(ПЦР) на антигены вирусов герпеса 1 и 2-го типа, ЦМВ, вирусов гепатита В и С,
вирусов Эпштейна-Барр. Полимеразная цепная реакция представляет собой
многократно повторяющиеся циклы синтеза (амплификацию) специфической области
ДНК-полимеразы, дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ), соответствующего солевого
буфера и олигонуклеотидных затравок – праймеров, определяющих границы
амплифицируемого участка ДНК – мишени. Каждый цикл состоит из трех стадии с
различными температурными режимами. На первой стадии при 94°С происходит
разделение цепей ДНК, затем при 57–62°С – присоединение (отжиг) праймеров к
гомологичным последовательностям на ДНК-мишени, и при температуре 72°С
протекает синтез новых цепей ДНК путем удлинения праймера в направлении 5ґ-3ґ.
В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что
позволяет за 35 циклов наработать фрагментов ДНК, ограниченных парой выбранных