Розділ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Для вирішення поставлених завдань в динаміці раннього неонатального періоду на першу, третю, п'яту добу життя проведено обстеження 90 новонароджених від жінок, інфікованих ВГЗ-2 (основна група), які народились в акушерських клініках Інституту педіатрії акушерства та гінекології АМН України і знаходились під наглядом і лікуванням у відділенні новонароджених. Групу порівняння склали 30 новонароджених від соматично здорових жінок.
Стан дітей при народженні оцінювали за шкалою Апгар, ступінь дихальних розладів - за шкалою Сільвермана, у всіх новонароджених враховували антропометричні дані, час відшарування пуповинного залишку, максимальне зменшення первинної маси тіла та строки її відновлення, наявність синдромів дизадаптації.
Поряд із загальноклінічним обстеженням проводили ультразвукове дослідження структур головного мозку за допомогою ультразвукового апарату SA-9900 фірми MEDISON (Корея) мікроконвексним датчиком на частоті 5-7,5 МГц в режимі реального часу.
Сканування головного мозку проводили через велике (переднє) тім'ячко у фронтальному, сагітальному та парасагітальному перетинах з вивченням структури паренхіми головного мозку, розмірів бокових шлуночків, третього, четвертого шлуночків, базальних цистерн.
Діагноз ВГВІ у новонароджених верифікували на підставі клінічних, серологічних, імунологічних, морфологічних та імуногістохімічних досліджень.
Важливим завданням є вибір імунологічних методів дослідження, що поєднують високу чутливість і специфічність з діагностичною та прогностичною значимістю отриманих з їх допомогою результатів [86, 162].
На сьогодні найбільш поширений імуноферментний аналіз, при використанні якого можна виявити специфічні антитіла IgM та IgG. Чутливість цього методу досить висока і складає 5-10 мг вірусного білка для ІФА. Принцип тестування полягає в тому, що антитіла, які є в дослідному матеріалі, складають імунні комплекси з антигенами ВГЗ-2 [91, 103, 123].
Ми використовували метод імуноферментного аналізу з метою встановлення наявності внутрішньоутробного інфікуванні новонародженого ВГЗ-2.
Вірусологічне обстеження проводили на 5-7 добу після народження. Матеріалом для обстеження була сироватка периферичної крові, в якій методом імуноферментного аналізу визначали специфічні антигерпетичні антитіла класів G, M.
Застосовували діагностичну тест-систему фірми "Abbott" США, двохвильовий аналізатор "Квантум -2" з модулем А. Крім того, використовували тест-системи IgM і IgG фірми "Novum Diagnostica" (Німеччина) і стриповий імуноферментний аналізатор "Stat fax -300" (США) при довжині хвилі 450 нм.
Враховуючи імуносупресивну дію вірусу на організм, недостатньо сформовану імунну систему дитини, в основному визначали рівень IgG антитіл, який до трьох місяців у дитини є материнським. В динаміці спостереження у дітей визначали і IgM антитіла до ВГЗ-2.
Заключний діагноз виставляли на основі анамнестичних даних матері, клінічних та лабораторних методів дослідження.
Для встановлення внутрішньоутробного інфікуванні новонародженого ВГЗ-2 застосовували метод ампліфікації ДНК за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), яка передбачає інкубацію зразків при трьох температурах, що відповідають трьом етапам циклу ампліфікації: денатурації ДНК, відпалення праймерів і пролонгації синтезуючого ланцюжка. Звичайно ДНК денатурують шляхом короткочасного підігріву зразка до 90-96о С, потім проводять відпал, охолоджуючи зразок до 40-60о С і далі підігрівають до 70-75о С, щоб здійснити добудову ланцюга ДНК, починаючи з відпалених затравок за допомогою Tag-полімерази. Як правило, розподіл ланцюгів здійснюється, коли реакційна суміш нагріта вище 90о С, тобто, щоб гарантувати розподіл, слід довести температуру суміші не менш, ніж до 93о С . Як тільки цей рубіж подоланий, зразок можна охолоджувати до температури відпалу затравки.
Подовженість інкубації при 72о С залежить від довжини ампліфікованої ділянки ДНК. Розмір ампліфікованих фрагментів перебуває в межах - 560-240 пар нуклеотидів. Праймери для ПЛР зазвичай мають довжину біля 20 нуклеотидів. Можливо синтезувати і довші затравки, але вони рідко бувають необхідними.
Окрім послідовності ДНК, яку необхідно ампліфікувати, і двох праймерів, специфічних відносно зв'язування з дослідним зразком, суміш містить буфер для Tag-полімерази, термостабільну ДНК-полімеразу Tag, дезоксирибонуклеозид-трифосфати. Звичайна концентрація ферменту в реакційній суміші становить 2 од. на 100 мкл реакційної суміші.
Для ампліфікації зразків ДНК, які мають високу кінетичну складність, наприклад, послідовностей геномної ДНК, оптимальна концентрація ферменту становить звичайно 1-4 одиниці на 100 мкл. реакційної суміші. Реакційна суміш має такий склад: 200 нг ДНК; по 125 пмоль кожного праймера; 200 мкМ dNTP; 0,5-1,2 од. Tag-полімерази; буфер для Tag-полімерази (50mM NaCI; 10mM Tris-HCI; 1, 5 mM MgCI2). Загальний об'єм реакційної суміші від 25 до 50 мкл. Щоб попередити втрату вологи за рахунок випарування з поверхні реакційної суміші, на неї нашаровують 15 мкл мінерального масла.
Виявлення ВГЗ-2 проводили на тест-системі Амплі-Сенс-200 для ампліфікації ділянки ДНК 500 нуклеотидних пар MIE-гена герпесвірусу, розробленою ЦНДІ епідеміології МОЗ РФ, згідно інструкції по застосуванню. Досліджуваний матеріал - сироватка крові. Перший етап роботи - підготовка пробірок для проведення ПЛР.
Підігрівали пробірку з воском ПЛР в термостаті при температурі 95о С для повного розплавлення. В пробірки для ампліфікації капали по 5 мкл ПЛР-суміші 1 (праймери і нуклеотиди), нашаровували зверху по 12-15 мкл розплавленого воску до повного покриття рідини. На поверхню застиглого воску капали по 10 мкл ПЛР-суміші 2 (буфер і Tag-полімераза). Зверху наносили по одній краплині мінерального масла для ПЛР.
Другий етап ПЛР - ампліфікація