РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Схеми дослідів і умови їх проведення
Експерементальні дослідження виконані на білих нелінійних щурах-самцях масою
120-150 г, які утримувались за стандартних умов віварію [88].
Фракціоноване тотальне опромінення тварин рентгенівськими променями здійснювали
впродовж 30 діб з інтервалом 24 години на рентгенівській діагностичній
установці 12 П6. Потужність експозиційної дози становила 0,258 мКл/с, напруга -
90 кВ, сила струму - 40 мА при алюмінієвому фільтрі та шкірно-фокусній відстані
– 48 см у щоденній дозі 0,258 мКл/кг (1 сГр), 0,516 мКл/кг (2 сГр), 0,774
мКл/кг (3 сГр) і 1,032 мКл/кг (4 сГр). Сумарні дози були: 7,74 мКл/кг (0,3 Гр)
(група 1), 15,48 мКл/кг (0,6 Гр) (група 2), 23,3 мКл/кг (0,9 Гр) (група 3) та
30,96 мКл/кг (1,2 Гр) (група 4), відповідно. Перерахунок поглинутої дози
проведено за [31]. Лазерне опромінення проводилось через попередньо поголену
шкіру на ділянку печінки по 60 с щоденно впродовж 10 діб (група 5), 20 діб
(група 6) і 30 діб (група 7) на апараті ЛГН-207-А ( л= 632,8 нм) діаметр
променя 0,3 см, вихідна потужність 1,3 мВт. Комбінована дія здійснювалась
опроміненням лазером впродовж 10 діб з подальшим впливом рентгенівського
випромінення за вище наведеною схемою в сумарній дозі 23,3 мКл/кг (0,9 Гр)
(група 8) і дія рентгенівського випромінення в сумарній дозі 23,3 мКл/кг (0,9
Гр) з наступним лазерним опроміненням в останні 10 діб 30-добового курсу
фракціонованого тотального опромінення рентгенівськими променями (група 9),
контроль (10 група).
Тварин декапітували під легким ефірним наркозом після закінчення курсу
рентгенівського, лазерного опромінення та їх сукупної дії, через 10, 20 і 30
діб по закінченні курсів опромінення (табл. 2.1). При проведені досліджень нами
виконані вимоги Європейскої конвенції щодо захисту хребетних тварин, які
використовуються для експериментів та інших наукових цілей (Страсбург, 1985).
Таблиця 2.1
Схема дослідів та умови їх проведення
№ гру-пи
Кіль-кість тварин у групі
Поглинута доза опромінення, Гр
Потужність лазерного променя, Вт/см2 с
Тривалість експозиції, доби
Термін взяття проб після дії чинника, доби
На фрак-
цію
Сумар-на
На фрак-
цію
Сумар-на
32
0,01
0,3
30
1, 10, 20, 30
32
0,02
0,6
30
1, 10, 20, 30
40
0,03
0,9
30
1, 10, 20, 30
32
0,04
1,2
30
1, 10, 20, 30
58
0.078
0.78
10
1, 10, 20, 30
32
0.078
1.56
20
1, 10, 20, 30
32
0.078
2.34
30
1, 10, 20, 30
32
0,03
0,9
0.078
0.78
10
30
1, 10, 20, 30
48
0,03
0,9
0.078
0.78
30
10
1, 10, 20, 30
10
96
Контроль
1, 10, 20, 30
Методи досліджень
Матеріалом для дослідів була печінка як основний орган детоксикації продуктів
обміну в організмі [57; 59]. Печінку заморожували в рідкому азоті.
Гомогенізацію печінки проводили у скляному гомогенізаторі Поттера під
візуальним контролем: 150 мг тканини у 1,5 мл 0,05 М Тріс-НСІ буфері (рН-7,4).
Визначення вмісту МДА І ДК. За основу методу визначення вмісту МДА покладено
його здатність за високої температури в кислому середовищі реагувати з
тіобарбітуровою кислотою (ТБК), утворюючи забарвлений триметиновий комплекс
[202].
До 0,4 мл 10 % гомогенату додавали 0,8 мл води, 0,06 мл 5 N HCI та 0,3 мл 17%
ТХО. Центрифугували 20 хвилин при 4000 g. До супернатанта додавали 0,5 мл 0,8%
ТБК і інкубували проби на водяній бані при t =1000C впродовж 10 хв. Контрольні
проби містили замість надосадної рідини 0,025 М Тріс – НСІ буфер (рН = 7,4), що
містив 0,175 М КСІ. Проби охолоджували до кімнатної температури і вимірювали
оптичну густину на довжині хвилі 532 нм на СФ-46. Отримані результати виражали
в ннмоль /мг білка.
Визначення вмісту дієнових кон'югатів проводили в суміші гексану та
ізопропанолу із визначенням оптичної густини гексанового шару [50].
До 0,2 мл 10 % гомогенату додавали до 2 мл суміші гексан-ізопропанол (1:1),
яку струшували впродовж 15 хв в скляних пробірках зі щільно закритими
поліетиленовими корками. Центрифугували 15 хв при 4000 g. До супернатанту
вносили по 0,5 мл 0,1N НСІ та 1 мл гексану. Інтенсивно струшували і залишали на
30 хв для розшарування фаз. Відбирали верхній гексановий шар і вимірювали Е233
на СФ-46. Концентрацію ДК виражали в нмоль /мг білка.
Визначення активності супероксиддисмутази (КФ 1.15.1.11). Активність ферменту
визначали в гомогенаті печінки за методикою Чеварі [219], заснованій на
здатності СОД конкурувати з нітросинім тетразолієм за супероксидні аніони, які
утворюються в результаті аеробної взаємодії відновленої форми НАД і
феназинметасульфату (ФМС). В результаті реакції нітросиній тетразолій
відновлюється з утворенням гідразинтетразолію. Для розрахунку активності
ферменту спочатку визначали відсоток інгібування реакції відновлення
нітросинього тетразолію за 1 хв. За одиницю активності СОД приймали кількість
ферменту, необхідного для 50 % блокування відновленого тетразолію за умов
досліду. Активність СОД виражали в од/хв мг білка.
Визначення активності каталази (КФ 1.11.1.6). Принцип методу полягає у
здатності пероксиду водню утворювати із солями молібдену стійкий забарвлений
комплекс, після чого вимірюється оптична густина розчину на спектрофотометрі
[113].
До 2 мл 0,03 % пероксиду водню додавали 0,05 мл 10 % гомогенату тканини.
Реакцію проводили при 370С у термостаті для гемокоагуляції з прозорими
стінками. Через 10 хв додавали 1 мл 4 % молібдату амонію. До контрольної
(холостої) проби замість гомогенату вносили 0,05 мл дистильованої води.
Вимірювали Е440хол і Е440досл. проти контролю – дистильованої во
- Київ+380960830922