РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Об’єкт дослідження
Для вивчення ішемічного ушкодження мозку існують різноманітні in vivo та in
vitro експериментальні моделі.
При моделюванні ішемії in vivo використовують припинення кровопостачання всього
головного мозку за допомогою чотири- або двосудинної оклюзії (так звана
глобальна ішемія), чи порушення кровообігу в окремій ділянці головного мозку -
фокальна ішемія.
У більшості випадків ішемічні умови in vitro моделюються за допомогою
киснево-глюкозної деприваціі з використанням спеціальної камери, в якій кисень
повітря замінюється на азот, а в середовищі культивування глюкоза замінюється
на сахарозу. Іноді використовують блокаду мітохондріального дихання хімічними
речовинами (цианіди, азиди) [142]. Дослідження in vitro можливо здійснювати на
гострих тканинних зрізах, дисоційованих клітинних культурах або органотипових
культурах. Кожна з цих моделей має свої переваги та недоліки.
Здатність гострих зрізів мозку, які були інкубовані в сольовому розчині,
зберігати життєздатність вперше була продемонстрована у 1924 році. На протязі
наступних 30 років цей метод використовувався для вивчення процесів дихання,
гліколізу та деяких інших процесів обміну речовин нормальної та патологічно
зміненої нервової тканини. Ці біохімічні роботи виявили значне співпадіння
метаболічних та електрофізіологічних характеристик тканини інтактного мозку та
його зрізів in vitro [143]. Але треба зауважити, що гострі зрізи мають дуже
обмежений час для досліджень, після чого вони втрачають життєздатність.
Дисоційована культура отримується шляхом механічної чи ферментативної
дисоціації тканини, в результаті чого утворюється суспензія відокремлених
клітин без збереження первинних зв’язків. Серед переваг треба відмітити:
можливість виділення “чистої” культури, яка містить певний тип клітин та
спостереження за змінами морфологічних і електрофізіологічних ознак у кожній
окремій клітині. Дані властивості роблять дисоційовані культури особливо
цінними для вивчення механізмів певних процесів. Серед недоліків – ці клітини
більше не є складовою частиною первинної нейрональної сітки, змінюється їх
зовнішній вигляд, метаболізм, реакції на ті чи інші впливи [13].
Органотипові культури є найбільш прийнятні для моделювання патологічних
процесів і мають такі переваги:
1) збереження в цій моделі життєздатності клітин, тканинних властивостей, а
саме, цитоархітектоніки, типів клітин та шарів, первинних міжклітинних
зв’язків, синаптичної організації, розташування рецепторів etc. [144, 145];
2) робота під безпосереднім візуальним контролем. Можлива локальна електрична
чи хімічна стимуляція певних частин нейронів (тіла, аксону, дендритів);
3) можливі тонкі хірургічні маніпуляції зі зрізом (ізоляція окремих частин,
розсічення аферентних шляхів, виділення відростків від тіл клітин);
4) присутній прямий доступ до позаклітинного простору, що дозволяє, з одного
боку, легко контролювати умови життєдіяльності тканини (склад солей та
метаболітів, pH, газове насичення та т.п.), а з іншого – надає можливість
прямого впливу на тканину хімічними речовинами потрібної концентрації.
Отже об’єктом нашого дослідження були культивовані зрізи гіпокампу щурів
(органотипова культура). Для одержання культур використовувались семиденні щури
лінії Вістар.
2.2. Виділення та культивування зрізів гіпокампу
Всі маніпуляції, пов’язані з отриманням тканинного матеріалу для органотипової
культури, а також наступні процедури зміни середовища та культивування
проходили у стерильних умовах.
Культивування зрізів гіпокампу проводилося за методом Stoppini коли тканина
розташована на межі поживного рідкого та газового середовища [144, 146].
Для виділення мозкової тканини використовували середовище виділення, яке
містило:
• 50% мінімального поживного середовища МЕМ (Cat. № 41200-015, Gibco);
• 5 ммоль Tris (T-1378, Sigma);
• 2 ммоль NaHCO3 (Cat.№ 25080-060, Gibco);
• 12,5 ммоль Hepes (Cat.№ 15630-056, Gibco);
• 15 ммоль D-глюкози (G-7021, Sigma);
• 100 од.д./мл пеніциліну (Cat. 15140-122, Gibco), 100 мг/мл стрептоміцину
(Cat. 26050-088, Gibco);
• 25 % 10-кратного сольового розчину HBSS (Cat. № 14180-038, Gibco)
розбавленого у співвідношенні 1 до 10 у деіонізованій воді;
• 25% деіонізованої води.
рН середовища - 7,3.
Середовище для культивування зрізів мало такий склад:
• 50% мінімального поживного середовища МЕМ;
• 2,5 ммоль Tris;
• 2 ммоль NaHCO3;
• 12,5 ммоль Hepes;
• 15 ммоль D-глюкози;
• 100 од.д./мл пеніциліну; 100 мг/мл стрептоміцину;
• 25 % кінської сироватки (Cat.№ 26050-047, Gibco);
• 25 % 10-кратного сольового розчину HBSS розбавленого у співвідношенні 1 до 10
у деіонізованій воді.
рН середовища - 7,2.
Середовища виділення та культивування стерилізували, використовуючи фільтри
Millipore Steritop SCGPT05RE з діаметром пор 0,22-мкм та зберігали при
температурі -200С кілька місяців.
Культивування проводили у 6-лункових планшетах, використовуючи додатково
спеціальні вкладиші з проникною мембраною, яка забезпечує проходження через неї
розчинних речовин. Один мілілітр середовища культивування додавався в кожну
лунку. Стерильні проникні вкладиші діаметром 30 мм та з розмірами пор 0,4 мкм
(Millicell-CM, Millipore) були розташовані в кожній лунці та змочувалися
середовищем культивування. Планшет залишали в СО2 інкубаторі не менш ніж на 1
годину для стабілізації температури (370С) та рН середовища культивування, до
того часу, коли на них будуть розташовані зрізи.
7-денних щурів декапітували, мозок обережно видаляли з черепної коробки та
перекладали в попередньо охолоджене середовище виділення. Сагітальним розтином
через Sulc
- Київ+380960830922