РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Робота виконана на базі клінік і лабораторій "Ісіда-IVF" та Інституту ПАГ АМН
України.
Для вирішення поставлених в роботі задач, у жінок після ЕКЗ, дослідження
проводили в наступному напрямку:
1. Клініко-параклінічне дослідження у 76 вагітних після ЕКЗ. 32 жінки, які
завагітніли самостійно, склали контрольну групу.
Всі вагітні оглядались терапевтом, окулістом, невропатологом.
Клініко-лабораторне обстеження проводилось згідно наказу МОЗ України №503.
2. Мікробіологічне дослідження для діагностики TORCH-інфекції використовували
метод імуноферментного аналізу (ІФА).
Визначення Ig G і Ig M-антитіл до токсоплазми, цитомегаловірусу (ЦМВ), герпесу
і краснухи проводили шляхом твердофазного імуноферментного сендвіч-аналізу із
використанням стандартних наборів моноклональних антитіл фірми Abbott (США).
Принцип методу заснований на тому, що на внутрішній поверхні лунок для мікро
титрування (що відіграють роль твердої фази) імобілізовані специфічні антигени.
Присутні у зразку сироватки специфічні антитіла Ig G або Ig M зв’язуються з
антигеном на стінках лунок. Незв’язаний матеріал видаляється промиванням.
Додають кролячі антитіла проти Ig G або Ig M людини, кон’юговані с пероксидазою
хрону. В результаті утворюється сендвіч, наприклад для Ig G проти HSV2-Ag.
HSV2-Ag * анти-HSV 2 AgІgG* анти-ІgG антитіла-пероксидази.
Після другого промивання, що видаляє незв’язаний кон’югат, визначали активність
пероксидази, яка імобізована на стінках лунки шляхом інкубації з субстратом
(тетраметилбензидином). Синій колір, що утворюється в присутності поміченого
ферментом імунного комплексу, переходить у жовтий після додавання сірчаної
кислоти, яка зупиняє реакцію. Інтенсивність жовтого фарбування пов’язана з
кількістю специфічних Ig G або Ig M в досліджуваному зразку. Значення
поглинання досліджуваних зразків сироватки порівнювали з такими в контролі
(cut-off control value, COV). Поглинання вимірювали при 450 нм на ридері для
мікропланшетів. Результати аналізу вважали позитивними, якщо поглинання зразку
(А450)>COV.
3. Мікроскопічні методи дослідження включали світову та люмінісцентну
мікроскопію одержаного матеріалу. З метою діагностики гонорейної,
трихомонадної, хламідійної, мікоплазмової, уреаплазмової інфекції та визначення
антибіотикочутливості використовували метод ІФА, полімеразної ланцюгової
реакції (ПЛР).
4. Гормональний моніторинг вмісту естрадіолу (Е2) та прогестерону (П) в крові
проведено на 5-8, 9, 11, 13, 15-17 тижнях вагітності. Вміст хоріонічного
гонадотропіну та РАРР-А в крові визначено на 11-12 тижні, вільного естріолу та
альфа-фетопротеіну - на 16-17 тижні вагітності. Гормональні дослідження
проведено імуноферментним методом за допомогою стандартних наборів системи
„DELFIA” на аналізаторі „1420 Victor 2” фірми Perken Elmer (США). Дослідження
проводили за інструкцією виробника.
5. Сонографічна фето- і плацентометрія та доплерометричні дослідження
проводилися в клініці ІСІДА-IVF на ультразвуковому сканері ATLHDJ 1500 (США) і
Medison 8000 (Корея).
В І триместрі вагітності за допомогою УЗД визначалося місце імплантації
плідного яйця, життєздатність ембріону, вимірювали його КТР, наявність
патологічних змін в хоріоні (ділянок відшарувань та інш.) з використанням
трансвагінального датчика [75,78].
В ІІ-ІІІ триместрах вагітності за допомогою УЗД визначали похідні фетометричні
показники: БПР голівки, враховували товщину і локалізацію плаценти, кількість
навколоплідних вод, особливої уваги приділяли ступеню зрілості плаценти. Крім
цього оцінювали наступні показники кровотоку в артеріях пуповини: S/D -
систоло-діастолічне співвіношення і RI – індекс резистентності [48,81].
6. Пацієнткам проводились імунологічні дослідження. Розширена імунограма
виконувалась на 6-8 тижнях вагітності методом трьохколірної проточної
цитометрії на проточному цитофлюорометрі FACScan фірми «Becton-Dickinson» (CШA)
з використанням моноклональних антитіл цієї ж фірми. Оцінювали характеристики
таких показників поширених імунограм: наявність і активність різних видів
імунних клітин, їх абсолютна та відносна кількість: Т-лімфоцитів,
В-лімфоцитів, Т-лімфоцитів-хелперів, цитотоксичних Т-лімфоцитів. Крім того,
оцінювали експресію хемокінових рецепторів на Т-хелперах, маркерів активації на
цитотоксичних Т-лімфоцитах та натуральних кілерах. Вивчали загальну активність
NK-клітин та активність однієї NK-клітини [159]. Зразки цільної крові у об’ємі
100 мкл розміщували у полістіролові пробірки (Falcon, США), до зразків крові
додавали відповідні реагенти моноклональних антитіл у об’ємі 20 мкл. Кров
ретельно перемішували з реагентами за рахунок струшування на приладі Minigen,
пробірки розміщували у темряві та інкубували за кімнатної температури протягом
30 хв. Після закінчення інкубації в кожну пробірку додавали по 1 мл лізуючого
розчину Lising Solution (Becton Dickinson, США) для лізису еритроцитів,
струшували на приладі Minigen, після чого залишали пробірки за кімнатної
температури на 10 хв. Після цього двічі відмивали клітини крові у надлишку
поліфосфатного буферу шляхом центрифугування 5 хв. при 200g. Надосад після
другого центрифугування видаляли, додавали в кожну пробірку по 500 мкл
поліфосфатного буферу, знову струшували для гомогенізації осаду клітин, після
чого зразки були готові для аналізу на проточному цитофлуориметрі.
Отримані зразки аналізували на лазерному проточному цитофлуориметрі FACScan
(Becton Dickinson, США) в режимі FACScan Research and Lysis software (Becton
Dickinson, USA) з процедурою накладання лейкоцитарного гейту. У кожній пробі
аналізувалося не менше за 5000 кл
- Київ+380960830922