Системні порушення імунітету та цитокінів при бронхіальній астмі у дітей.

ГЛАВА 2
ОБЪЕКТ НАБЛЮДЕНИЙ. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. КЛИНИЧЕСКАЯ
ХАРАКТЕРИСТИКА ОБСЛЕДОВАННЫХ БОЛЬНЫХ
2.1. Объем и методы исследования
Исследования проведены в 2000-2005 г.г. в пульмонологическом отде­лении
городской детской клинической больницы № 16 г. Харькова (главный врач -
Т.В.Харченко) - базе кафедры факультетской педиатрии Харьковского
государственного медицинского университета, пульмонологическом отделе­нии
Харьковской областной детской клинической больницы (главный врач –Г.Р.Муратов)
и пульмонологическом и аллергологическом отделе­ниях Харьковской областной
детской клинической больницы №1 (главный врач - Н.Б.Зайцева), а также в
лаборатории биохимических исследо­ваний (зав. отделом экспериментальных методов
исследований Ф.А.Колодуб) Института терапии АМН Украины, г. Харьков (директор -
проф. О.Я.Бабак).
Под наблюдением находились 136 детей в возрасте от 2 до 16 лет, из них 110
больных бронхиальной астмой и 26 здоровых детей аналогичного воз­раста,
составившие группу контроля.
Основным методом работы явились клинико-лабораторные исследование с анали­зом
клинико-лабораторных и инструментальных данных. Программа исследо­ваний
включала комплексное клиническое, функциональ­ное обследование пациентов с
оценкой показателей физического развития, анализа данных анте-, интра- и
постнатального периодов; лабораторные (общеклинические, биохимические,
иммунологические показате­ли) и инструментальные (спирография, пикфлоуметрия)
методы иссле­дований.
Диагноз заболевания верифицировали и формулировали согласно кри­териям,
предложенных Международным Консенсусом по бронхиальной астме и принятых II
съездом фтизиатров и пульмонологов Украины (Киев, 1998).
Клинические исследования крови, мочи и мазков-отпечатков слизистой оболочки
носа проводили по общепринятым методам (В.Е.Предтеченский, [96]);
фракционирование белков - методом горизонтального электрофореза, содержание
общего белка в сыворотке крови - унифицированным биуретовым методом (В.Г.Колб,
В.С.Камышников [58]); гликопротеиды и серомукоид в сыворотке крови -
унифицированным орциновым методом после гидролиза серной кислотой [78].
Содержание электролитов (калия и натрия) в плазме измеряли методом пламенной
фотометрии по В.М. Бриккер [14], кальция в сыворотке крови -
комплексонометрическим титрованием, неорганического фосфора -
молибденово-кислым способом [94].
Иммунологические методы включали: определение уровней основных классов
иммуноглобулинов (А, М, G) в сыворотке крови методом радиальной иммунодиффузии
в агаре Difko по G.Manchini et al. [179]; уровня общего IgE в сыворотке крови
при помощи иммуноферментного анализатора с использованием тест-системы фирмы
«Labodia» (Швейцария); уровня IgE в слюне при помощи иммуноферментного
анализатора с использованием тест-системы фирмы «Тема» (Москва); циркулирую­щих
иммунных комплексов (ЦИК) - по V.Haskova et al. [160] в модификации
Ю.А.Гриневича и А.Н.Алферова (1978). Клеточное звено иммунитета изучали путем
определения в крови уровня В-лимфоцитов (CD19) и субпопуляций Т-лимфоцитов
(CD3, CD4, CD8) с помощью моноклональных антител, меченных Fiec, методом
иммунофлюоресценции на иммунофлюоресцентном микроско­пе, используя коммерческие
наборы «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург), а так же Т0 и Такт-лимфоцитов по
методу H.Fudenberg et al. (1975); фагоцитарную активность нейтрофилов - с
помощью теста спонтанно­го поглощения и восстановления нитросинего тетразолия
(НСТ-тест) по методу J.Stuart et al. в модификации Б.С.Нагоева [80].
Состояние интралейкоцитарных микробиоцидных систем полиморфноядерных
нейтрофилов периферической крови оценивали по содержанию гранулоцитарных
факторов - миелопероксидазы (МП) и лизосомально-катионных белков (ЛКБ).
Определяли средний цитохимический коэффициент (СЦК) содержания МП в нейтрофилах
по методу Грэхема-Кноля и СЦК содержания ЛКБ по методу М.Г.Шубича [78].
Изуче­ние уровней цитокинов ИЛ-1-в, ИЛ-4, ФНО-б в сыворотке крови проводилось
иммуноферментным методом по стандартному протоколу тест-системы «ProCon»
(Санкт-Петербург), цитокинов ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-13 - иммуноферментным методом по
стандартному протоколу тест-системы «Diaclone» (Франция), адгезивных молекул
sICAM-1 - иммуноферментным методом по стандартному протоколу тест-системы
«human sICAM-1 BMS201» ( Австрия), а уровня оксида азота в сыворотке крови -
спектрофотометрическим ме­тодом Грисса-Илосвая [146] с сульфаниловой кислотой и
1-нафтоламином. Изучение уровня нитрита в плазме крови проведено
фотоколориметрическим определением оптической плотности окрашенного комплекса
нитрита с реактивом Грисса.
Состояние функции дыхательной системы оценивалось ме­тодом спирометрии с
помощью пневмотахографа фирмы Custo-Vit (Германия) утром натощак, при этом
исключив накануне прием бронхоспазмолитиков. После предварительной тренировки
пациенты трижды выпол­няли форсированный вдох и выдох. Полученные результаты
рассчитывались с учетом антропометрических показателей пациента, а также
температуры и влажности воздуха в помещении в абсолютных числах и процентах от
инди­видуальных должных показателей, рассчитанных по формулам Европейского
товарищества угля и стали [109].
При проведении спирометрии определяли и анализировали следующие показатели:
-ФЖЕЛ - форсированная жизненная емкость легких по выдоху;
-ОФВІ - объем форсированного выдоха за первую секунду (в % от долж­ных
величин), который является наиболее информативным показателем для оценки
бронхообструкции и тяжести бронхиальной астмы;
-ПОСвыд - (ПОС) - пиковая объемная скорость выдоха;