РОЗДІЛ 2
ОБ’ЄКТИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Об’єктом дослідження були штами біфідобактерій, ізольовані з шлунково-кишкового
тракту людини, сільськогосподарських тварин і комах. Штами зберігалися в
колекції відділу фізіології промислових мікроорганізмів ІМВ НАНУ понад 25 років
(табл. 2.1), а також нові штами, які були ізольовані з кишечнику людини,
дельфінів, лабораторних тварин (мишей), комах і з біопродуктів (табл. 2.2).
Таблиця 2.1
Видовий склад музейних штамів біфідобактерій колекції
НАН України
Назви видів
ізоляти з травного тракту людини
ізоляти з травного тракту теплокровних тварин і комах
Bifidobacterium bifidum G
Bifidobacterium globosum ATCC 25864
Bifidobacterium bifidum ATCC 15696
Bifidobacterium globosum 2
Bifidobacterium catenulatum ATCC 27539
Bifidobacterium animalis ATCC 26536
Bifidobacterium liberorum ATCC 15702
Bifidobacterium magnum ATCC 27540
Bifidobacterium breve ATCC 15700
Bifidobacterium ruminale ATCC 25866
Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703
Bifidobacterium ruminale 2
Bifidobacterium parvulorum ATCC 15698
Bifidobacterium asteroidеs ATCC 25909
Bifidobacterium sp. 93
Bifidobacterium sp. Д124
Bifidobacterium longum ATCC 15707*
Bifidobacterium indicum ATCC 25812*
10
Bifidobacterium angulatum ATCC 27535*
10
Bifidobacterium corineforme ATCC 25911*
11
Bifidobacterium infantis ATCC 15697*
12
Bifidobacterium pullorum ATCC 27687*
11
Bifidobacterium suis ATCC 27533*
13
Bifidobacterium dentium ATCC 27534*
14
Bifidobacterium sp. 82*
* - штами, що не вижили
Виділення і оживлення. Для виділення чистих культур біфідобактерій
використовували свіжовиділені фекалії дистального відділу кишечника людини,
сільськогосподарських і лабораторних тварин, відібрані з дотриманням правил
асептичних умов.
Чисті культури біфідобактерій кишечника дельфінів отримували в період чергового
планового обстеження тварин (червень 2003 р.). Дорослу особину
Таблиця 2.2
Штами біфідобактерій, виділені з різних природних джерел
штами
джерело виділення
Bifidobacterium sp. BB-12
біойогурт
Bifidobacterium sp. ABT-1
біоряжанка
Bifidobacterium sp. ABT-2
біокефір
Bifidobacterium sp. L9
кишечник дитини
Bifidobacterium adolescentis PM
Bifidobacterium sp. М39/1
кишечник лабораторних тварин (мишей)
Bifidobacterium sp. М39/2
Bifidobacterium sp. Д69/1
кишечник дельфінів
Bifidobacterium sp. Д69/2
Bifidobacterium sp. Д69/3
Bifidobacterium sp. А53/1
кишечник бжіл
Bifidobacterium sp. А53/2
Bifidobacterium sp. А5
Bifidobacterium sp. А7
дельфіна винурювали з води, поміщали на місток і проводили забір матеріалу для
дослідження. Для цього стерильним ватним тампоном проводили змив із анального
отвору тварини (в глибину близько 2-3 см), з площі поверхні близько 10 см2, з
наступним суспендуванням в стерильному фосфатному буфері (КН2PO4 - 0,45г,
Na2HPO4 – 5,34г, H2O – 1л). Витримували декілька годин при кімнатній
температурі, а потім розводили в 2 рази стерильною морською водою і
ресуспендували.
Виділення біфідобактерій із бджіл проводили в період ранньої весни (березень
2003 р.) до початку обльоту, коли в кишечнику комах міститься найбільша
кількість мікроорганізмів. Перед початком препаровки комах присипляли,
витримуючи при -40єС 5-10 хвилин. Препарування бджіл проводили в асептичних
умовах: занурювали на 2-3 сек в 96° етанол. Залишки спирту на верхніх покривах
видаляли шляхом проведення комахи через полум’я газового пальника. Далі комаху
за допомогою стерильних інструментів поміщали в стерильну чашку Петрі і
препарували за методом Є.Н. Павловського [19]. Відпрепарований зобик бджоли
разом із вмістом переносили в спеціальний стерильний бюкс. Кишечний матеріал
від 100 особин ретельно гомогенізували, додаючи поступово 2 мл стерильного
фізіологічного розчину.
З продуктів функціонального харчування біфідобактерії отримували шляхом
серійних десятикратних розведень 1г продукту в фізіологічному розчині з
подальшим висівом на агаризоване середовище і відбором одиничних колоній.
Мікробіологічний посів досліджуваних зразків проводили не пізніше 2 годин після
відбору за методом Коха.
Переведення культур біфідобактерій, що зберігалися в ампулах, в фізіологічно
активний стан проводили в асептичних умовах. Ампулу протирали 70° етанолом,
вскривали поблизу полум’я газового пальника. До ліофілізованої культури
додавали 1 мл стерильного фізрозчину і висівали на поживне середовище.
У ході роботи було здійснено підбір середовища, оптимального для виділення і
культивування досліджуваних штамів біфідобактерій. Для цього були випробувані 4
склади живильних середовищ (таблиця 2.3).
Кукурудзяно-лактозне (КЛС). Це середовище найбільш доступне, а також просте у
приготуванні.
Середовище Блаурока. Потребує спеціально обробленої печінки як редукуючого
фактору для культивування біфідобактерій.
Модифіковане середовище MRS. В класичне середовище для культивування
молочнокислих бактерій [138] додавали цистеїн як відновник окисно-відновного
потенціалу.
Середовище “Біфідум”. Готове напіврідке середовище, яке останнім часом
використовується в лабораторній практиці.
По 1 мл посівного матеріалу з розведень 105-1010 вносили в 15 мл (для утворення
високого стовпчика) кожного з середовищ. Культивували при 37єС 24-48 годин в
анаеробних умовах. При обрахуванні результатів враховували кількість
біфідобактерій.
Таблиця 2.3
Середовища для культивування біфідобактерій
інгредієнти
Склад середовища (% на 1л дистильованої води)
Кукурудзяно-лактозне середовище
Середовище Блаурока
Модифіковане середовище MRS
середовище „Біфідум”
Панкреатичний гідролізат казеїну
Пептон
М’ясна во
- Київ+380960830922