РОЗДІЛ 2
ВИБІР НАПРЯМКІВ ДОСЛІДЖЕНЬ. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ВИКОНАННЯ РОБОТИ
2.1. Вибір напрямків досліджень
Аналіз літературних даних свідчить, що в даний час поширення та етіологічна структура лептоспірозу великої рогатої худоби недостатньо вивчені в Північно-Західному регіоні України. Відсутні дані щодо зміни морфофункціональних показників організму при розвитку хвороби. Потребує вивчення питання особливостей перебігу інфекційного та показників прояву епізоотичного процесів, зумовленого сумісною участю одночасно декількох серологічних груп лептоспір. Не вивчене питання формування поствакцинального імунітету при проведенні вакцинації у великої рогатої худоби моновалентними вакцинами. Також відсутні дані по застосуванню сучасних антибіотиків для лікування лептоспіроносіїв та клінічно хворої великої рогатої худоби.
В даний час актуальним напрямком при лептоспірозі великої рогатої худоби є розробка системи моніторингових досліджень, вчасної діагностики та профілактики хвороби.
Дослідження за темою дисертаційної роботи виконувалися протягом 2003 - 2005 років на кафедрі заразних хвороб тварин Державного агроекологічного університету, в господарствах Житомирської області, районних та обласній державних лабораторіях ветеринарної медицини.
2.2. Матеріали для виконання роботи
Матеріалом досліджень були статистичні дані обласного управління державної ветеринарної медицини Державного департаменту ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України, Житомирської обласної державної лабораторії ветеринарної медицини, районних державних лабораторій ветеринарної медицини.
За період виконання дисертаційної роботи піддано аналізу результати досліджень біля 40 тисяч проб сироваток крові від великої рогатої худоби.
Серологічні дослідження на лептоспіроз (шляхом постановки РМА) проведені з власною участю в Житомирській обласній лабораторії державної ветеринарної медицини. Проби крові доставляли як при плановому дослідженні поголів'я великої рогатої худоби, так і з дослідного господарства. Особисто досліджено в РМА 135 голів великої рогатої худоби.
2.3. Методи досліджень
При вивченні особливостей епізоотичного процесу, перебігу і клінічного прояву лептоспірозу використовували комплексний епізоотологічний метод. Епізоотологічне дослідження проводили згідно "Методических рекомендаций по эпизоотологическому исследованию" (Бакулов И. А. и соавт., 1982). При проведенні цих досліджень використовували методичні розробки "Методы эпизоотического исследования и теория эпизоотического процесса" (Джупина С. И., 1991) та "Материалы эпизоотической и методы эпизоотической нозеографии" (Нуйкин Я. В., 1977). При цьому визначали показники захворюваності, летальності, неблагополучності та інтенсивності поширення хвороби серед поголів'я великої рогатої худоби.
Клінічні обстеження тварин, визначення гемоглобіну за допомогою ФЕКа, кількості еритроцитів і лейкоцитів проводили за загальноприйнятими методиками, активність АСТ, АЛТ - методом Райтмана - Френкеля, ГГТ- згідно настанови про їх визначення [168, 169]; каротин - методом екстрагування [170].
2.3.1. Методика визначення активності аспартат - амінотрансферази та аланін - амінотрансферази.
Визначення активності аспартат-амінотрансферази та аланін-амінотрансферази проводили за методом Райтмана-Френкеля [168]. Похибка становить не більше 5%. В пробірку вносили субстратно-буферний розчин в кількості 0,4 мл, як у контрольну так і в дослідну проби, та проводили інкубацію протягом 3 хвилин. Після додавання у контрольну пробу 0,4 мл стоп-реагенту у дослідні пробірки вносили по 0,08 мл сироватки крові, ретельно перемішували. Після інкубації у термостаті, з примусовим рухом повітря при температурі 37 ±0,10С, у дослідні проби додавали стоп-реагент та залишали при кімнатній температурі. Через 20 хвилин до проб додавали розчин їдкого натрію, та знову ж залишали на 10 хвилин при кімнатній температурі. Вимірювали оптичну щільність дослідної проби проти контрольної (індивідуально для кожної проби сироватки) при довжині хвилі 450 нм. Розрахунок активності ферменту проводили по калібрувальному графіку. Для побудови калібрувального графіка готували розчин у 5 пробірках, що відповідали калібрувальним точкам, та контрольну пробу. По осі абсцис відкладали величину активності АсАТ (мкмоль/год. мл), а осі ординат - вміст піровиноградної кислоти в калібрувальному розчині (мкмоль).
Суть методу Райтмана-Френкеля заключається в тому, що в результаті амінування 2-оксоглутарової кислоти альфа-аспарагіновою кислотою, що проходить під дією аспартат-амінотрансферази, утворюється альфа-глутамінова і щавелооцтова кислоти, остання самовільно декарбоксилюється з утворенням піровиноградної кислоти. Визначення грунтується на вимірюванні оптичної щільності гідразонів глутарової та піровиноградної кислот в лужному середовищі.
2.3.2. Методика визначення вмісту каротину в сироватці крові.
Визначення каротину проводили методом екстрагування [170].
Суть методу полягає у осадженні каротиноїдів спиртом та екстрагуванні його з осаду петролейним ефіром чи авіаційним бензином.
Реактиви: етанол (96%), петролейний ефір чи авіаційний бензин, калій двохромовокислий.
Обладнання: ФЕК-56М, центрифуга, піпетки на 2 і 10 мл.
Методика визначення. В центрифужні пробірки вносили по 1 мл сироватки крові, 3 мл етилового спирту. Вміст пробірок перемішували тонкою скляною паличкою до утворення однорідної суміші, до якої додавали 6 мл петролейного ефіру чи авіаційного бензину. Пробірки із сумішшю закривали корками, інтенсивно струшували протягом 1-2 хвилин, додавали по стінці пробірки по 0,5 мл дистильованої води і ставили у штатив на 10 хвилин для розділення органічної та неорганічної фаз. Верхній шар рідини, що містить каротиноїди (4-4,5 мл), відбирали у чисті пробірки і визначали оптичну щільність дослідних зразків та робочого стандартного розчину калію двохромовокислого проти кон