РОЗДІЛ 2
ВИБІР НАПРЯМІВ ДОСЛІДЖЕНЬ, МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ВИКОНАННЯ РОБОТИ
Дослідження виконували протягом 2004–2007 років в лабораторії лептоспірозу
сільськогосподарських тварин з музеєм штамів мікроорганізмів Інституту
ветеринарної медицини Української академії аграрних наук (ІВМ УААН); в
господарстві СТОВ “Агросвіт ” Київської області; господарстві АПК
“Криворіжсталь” Дніпропетровської області.
З метою вивчення епізоотології лептоспірозу свиней, особливостей його поширення
та територіальної приуроченості спалахів даного захворювання було
проаналізовано, піддано картографічному аналізу та проведено статистичні
дослідження:
- епізоотичного стану з лептоспірозу свиней в господарствах України;
- результатів лабораторних досліджень обласних лабораторій ветеринарної
медицини (за період виконання дисертаційної роботи було піддано аналізу
результати досліджень 856679 проб сироваток крові свиней).
З метою вивчення циркуляції L. interrogans, серовару bratislava (серогрупа
Australis) серед свинопоголів’я на території України, досліджено в реакції
мікроаглютинації (РМА) проби сироваток крові від 1297 свиней.
В роботі були використані сучасні методи епізоотологічного аналізу: моніторинг
епізоотичної ситуації щодо лептоспірозу свиней; проведені ретроспективні,
серологічні та експериментальні дослідження.
2.1. Штами лептоспір та умови їх культивування
Дослідження проводили з діагностичними та вакцинними штамами лептоспір, перелік
яких наведений в таблиці 2.1.
Таблиця 2.1 – Перелік штамів лептоспір, які були використані при проведенні
досліджень
№ п/п
Серогрупа
Серовар
Штам
Sejroeд
polonica
493 Poland
Hebdomadisд
kabura
Kabura
Tarassoviд
tarassovi
Perepelicyni
Pomonaд
pomona
Pomona
Grippotyphosaд
grippotyphosa
Moskva V
Canicolaд
canicola
Hond Utrecht IV
Icterohaemorrhagiaeд
copenhageni
M 20
Australisв
bratislava
Yeћ bratislava
Icterohaemorrhagiaeв
icterohaemorrhagiae
ВГНКИ-2
10
Pomonaв
monjakov
ВГНКИ-6
11
Tarassoviв
tarassovi
ВГНКИ-4
д – діагностичні штами лептоспір, якими користуються при діагностиці
лептоспірозу тварин лабораторії ветеринарної медицини України (малий
діагностичний ряд);
в – штами лептоспір, які були використані при виготовленні дослідних серій
вакцин.
При культивуванні лептоспір використовували живильні середовища Терських та
Кортгофа зі вмістом 10% сироватки крові овець або 7 – 10% сироватки крові
кролів. Культивування лептоспір проводили на вказаних середовищах при 27-28°С.
Прописи виготовлення використаних середовищ наведені нижче:
Середовище Кортгофа
До складу даного середовища входять (на 500 см3 дистильованої води): пептон –
400 мг, хлорид натрію (NaCl) – 700 мг, гідрокарбонат натрію (NaHCO3) – 10 мг,
хлорид калію (KCl) – 20 мг, хлорид кальцію (CaCl2) – 20 мг, калій
фосфорнокислий однозаміщений (KH2PO4) – 90 мг, натрій фосфорнокислий
двозаміщений (Na2HPO4) – 480 мг. Суміш автоклавували при 0,08 МПа 30 хв.
Протягом 12 год відстоювали і фільтрували через 3 шари цупкого фільтрувального
паперу (ватман №1). Середовище стерилізували автоклавуванням при 0,1 МПа 1 год
і фільтрацією через фільтраційні пластини “СФ – 3”. В стерильних умовах
додавали вітаміни В1 і В12 з розрахунку 0,5 мг/дм3.
Середовище Терських
Спочатку виготовлялись маточні розчини: розчин натрію фосфорнокислого
двозаміщеного ( на 1 дм3 дистильованої води 11,876 г Na2HPO4ЧH2О ); розчин
калію фосфорнокислого однозаміщеного (на 1 дм3 дистильованої води 9,078 г
KH2PO4 ) Зберігали ці розчини не більше трьох місяців при температурі 4°С в
темному місці. Для виготовлення середовища Терських змішували 800 см3 маточного
розчину Na2HPO4ЧH2О і 200 см3 KH2PO4. Величина рН середовища повинна
відповідати 7,2–7,4. Середовище автоклавували при 0,1 МПа 1год.
Підтримку імуногенних властивостей вакцинних штамів лептоспір проводили за
допомогою 5-ти кратних пасажів через організм морських свинок (віком 2-3
тижні).
Піддослідним тваринам вводили внутрішньочеревно культуру лептоспір у дозі 2 см3
з накопиченням 60–80 лептоспір у полі зору мікроскопа. На третю добу тварин
забивали. Від трупів морських свинок відбирали внутрішні органи (печінка,
нирки, серце) та гомогенізували їх. Одержану гомогенізовану суспензію з
внутрішніх органів ін’єкціювали інтраперітонеально в дозі 2 см3 наступній
морській свинці, яку також витримували 3 доби, після чого її забивали і т. д.
Таким чином було проведено 5 пасажів по кожному з чотирьох штамів лептоспір, з
яких була виготовлена вакцина.
Очищення культур лептоспір проводили за допомогою біологічного методу. З цією
метою забруднену сторонньою мікрофлорою культуру лептоспір вводили
внутрішньочеревно золотистим хом’ячкам в дозі 0,5 см3, через 50–60 хвилин кров
із серця зараженої тварини висівали в пробірки з живильним середовищем.
2.2. Постановка реакції мікроаглютинації (РМА)
Проби сироваток крові досліджували в реакції мікроаглютинації (РМА) з метою
встановлення діагнозу на лептоспіроз та виявлення імунного статусу вакцинованих
тварин. При постановці РМА в якості антигену були використані 7 діагностичних
штамів лептоспір серогруп Sejroe, Hebdomadis, Tarassovi, Pomona, Grippotyphosa,
Canicola, Icterohaemorrhagiae, (малий діагностичний ряд), в доповненні
еталонним штамом Yeћ bratislava, отриманим із Берлінського Інституту захисту
споживачів і ветеринарної медицини з люб’язного дозволу доктора Арно Шенберга в
1997 р. Їх перелік наведений у розділі 2.1.
При проведенні досліджень використовували культури лептоспір 7–14 добового віку
з накопленням 50–100 лептоспір у полі зору мікроскопа, з харак
- Київ+380960830922