<p>РОЗДІЛ 2<br />МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ<br /> Загальна схема досліджень наведена на рис. 2.1.<br /> 2.1. Відбір яєчників забитих свиней та доставка їх в лабораторію. Для одержання ооцитів відбирали яєчники свиней породи велика біла у загальній кількості 107 голів. Яєчники відбирали від гінекологічно здорових тварини перед досягненням статевої зрілості [134, 141], а також від свиноматок, яєчники яких знаходилися на стадії фолікулярного росту або із старими жовтими тілами. Яєчники доставляли в лабораторію в термосі при температурі +30 - +33?C протягом 1,5 - 2,5 годин. Після доставки в лабораторію яєчники промивали 4 рази у теплому (+37 - +38?C) стерильному фосфатно-сольовому розчині Дюльбекко (PBS) із 0,075 мг/мл канаміцин- сульфату (Antibiotic.Co, Bulgaria) [23]. <br /> 2.2.Одержання незрілих ооцитів свиней. Видалення ооцит-кумулюсних комплексів (ОКК) з антральних фолікулів яєчників здійснювались шляхом розсічення фолікулів лезом безпечної бритви в PBS із 0,075 мг/мл канаміцин-cульфату. Видалення ооцитів, їх відбір та постановку на дозрівання, запліднення і подальше культивування проводили у стерильних умовах боксу. Температура в боксі підтримувалась на рівні +22 - +25?С.<br /> Для культивування відбирали ооцити діаметром 120 - 130 мкм. ОКК свиней мали щільний, багатошаровий кумулюс, неушкоджену прозору оболонку і гомогенну невакуолізовану ооплазму правильної округлої форми, без морфологічних ознак просунутої атрезії [23].<br /> 2.3. Дозрівання ооцитів свиней в умовах in vitro. Вилучені ОКК шестиразово відмивали в середовищі 199, яке складається з 25 мМ буфера Hepes (Sigma) і 10% сироватки крові великої рогатої худоби власного приготування з послідуючим і одноразовим промиванням в середовищі для <br />Рис. 2.1. Загальна схема досліджень<br />дозрівання (середовище 199 на розчині Ерла (Sigma). В це середовище додавали 20% еструсної сироватки корів інактивованої нагріванням (+56?C, 30 хвилин), 0,068 мг/мл канаміцин сульфату, 0,11 мг/мл пірувату натрію і 0,1 мг/мл глутаміну. Відбір та відмивання ОКК здійснювали на нагрівальному столику при +37?С. ОКК свиней культивували in vitro в середовищі для дозрівання протягом 44 - 46 годин в пластикових чашках Петрі (по 25 - 30 ОКК у 1мл). При дозріванні ооцитів використовували свіжоотримані клітини гранульози концентрації (3 - 5х106, 15 - 25х106, > 25х106 клітин на мл). Клітини гранульози отримували із антральних неатретичних фолікулів (діаметр 3 - 4 мм) яєчників свиней з морфологічно нормальними ооцитами [23].<br /> 2.4. Одержання та підготовка епідидимальних сперматозоїдів кнурів до запліднення in vitro. Придатки сім'яників (епідидиміси) відбирали у забитих статевозрілих самців. В лабораторію епідидиміси доставляли протягом 6 - 12 годин, при температурі +20 - +250С. Сперматозоїди одержували шляхом розрізання епідидимісів лезом безпечної бритви. Для заморожування одержаних сперматозоїдів (150 - 200 млн./мл) у формі відкритих гранул використовували лактозо-гліцерино-жовтковий розбавник (ЛГЖ) та "Біоконсан"[27]. Осіменіння дозрілих in vitro яйцеклітин свиней проводили з використанням заморожено-розморожених в необлицьованих гранулах сперматозоїдів, одержаних із придатків сім'яників (епідидимісів) статевозрілих самців [32]. При осіменінні яйцеклітин поза організмом видалення розріджувача та відбір рухливих гамет проводили методом спливання або "флотації" (swim-up). При цьому застосовували одноразове 15-хвилинне спливання найбільш рухливих сперматозоїдів у флаконах, розміщених під кутом 45?. На дно похилених флаконів (4 - 6 шт.) до 1мл модифікованого середовища TALP без іонів Са2+ [138] додавали 0,2 мл суспензії сперматозоїдів з наступним відбором поверхневого шару середовища. Відібрану суспензію рухливих гамет центрифугували при 3100 об/сек (900g) протягом 5 хвилин, і відбирали супернатант. <br /> 2.5. Запліднення ооцитів та отримання зародків свиней in vitro. Яйцеклітини свиней після дозрівання in vitro перед осіменінням самостійно втрачають клітини кумулюсу. Піпетування і 5 - 6 разове відмивання ооцитів після дозрівання проводили в середовищі TALP для відмивання [138]. Капацитовані поза організмом сперматозоїди кнура та яйцеклітини свиней спільно інкубували в середовищі TALP-IVF [138] з додаванням 10 мкг/мл гепарину та суміші ПГЕ (20 мкМ пеніциламіну, 10 мкМ гіпотаурину та 1 мкМ епінефрину) протягом 4 та 18 годин при концентрації рухливих сперматозоїдів 250, 600 тис., 1,5 млн./мл та температурі 38,5?С і 5% СО2 в атмосфері повітря і рН середовища 7,8. Для візуальної оцінки рухливості сперматозоїдів використовували мікроскоп МБС-9. Концентрацію чоловічих гамет визначали за допомогою камери Горяєва [63]. Виявлені візуально яйцеклітини, які не роздробилися через 24 години культивування, фіксували за модифікованим методом Тарковського з наступним фарбуванням сухоповітряних препаратів 2%-ним розчином барвника Гімза. Нормально заплідненими вважали яйцеклітини із двома пронуклеусами (при наявності одного пронуклеуса яйцеклітини вважали активованими до партеногенетичного розвитку, а однією з причин наявності трьох або більшої кількості пронуклеусів може бути поліспермне запліднення). Ембріони вважають такими, що нормально розвиваються при наявності морфологічно нормальних інтерфазних або прометафазних ядер, кількість яких відповідає кількості бластомерів.<br /> Відмиті від сперматозоїдів зиготи культивували in vitro у середовищі NCSU-23 та NCSU-37 [123]. Культивування ембріонів свиней in vitro до стадії морули-бластоцисти проводили протягом 7 - 8 днів.<br /> 2.6. Центрифугування незрілих ооцитів свиней з метою виявлення ядра. В дослідах використовували одержані із яєчників забитих тварин незрілі ооцити свиней без морфологічних ознак просунутої атрезії, звільнені від клітин кумулюсу піпетуванням. Центрифугування незрілих ооцитів свиней здійснювали при 14000g протягом 15, 20 та 25 хвилин в пробірках для центрифугування у середовищі 199 з 20% сироватки крові великої рогатої худоби. Після центрифугування ооцити аналізували під світловим мікроскопом Jenaval із звичайною оптикою.</p>
- Київ+380960830922