РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И СПОСОБЫ ОБРАБОТКИ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
Опыты выполнены на 658 белых половозрелых крысах лини "Вистар" обоих полов массой 170-230 г. Все животные прошли 2-х недельный карантин и содержались в виварии Дон ГМУ им. М. Горького на стандартном водно-пищевом рационе при свободном доступе к воде и еде.
Биохимические исследования проводились в центральной научно-исследовательской лаборатории ДонГМУ им. М. Горького, аккредитированной МОЗ Украины (аттестат аккредитации № 0017113 от 30.02.04). Эксперименты проводились с учётом методических рекомендаций ГФЦ МОЗ Украины "Доклинические исследования лекарственных средств " (А.В. Стефанов, 2001) и требований комиссии ДонГМУ им. М. Горького по биоэтике (заключение №144/16 от 14.02.06).
Изучали антиамнестическую и антиоксидантную активность глицина ("Реахим", Россия), пирацетама (ноотропил, "Polfa"), карбацетама (институт физико-органической химии и углехимии НАН Украины, Донецк), аркаина и спермина ("RBI", США), мемантина ("Merc", Германия), серии адамантилсодержащих полиаминов (ИЭМ-1460, ИЭМ-1490, ИЭМ-1592, ИЭМ-1755), синтезированных д. х. н. В. Е. Гмиро в Институте Экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург (см. Табл. 2.1). Строение и чистота соединений подтверждены данными элементарного анализа, спектральными и хроматографическими методами. Согласно рекомендациям проблемной комиссии "Фармакология" от 30.10.2002, экспериментальные дозы веществ серии ИЭМ составляли 1/10 от ЛД50 (условно-терапевтические дозы). ИЭМ-1490 и ИЭМ-1592 использовали в дозе 3 мг/кг; ИЭМ-1755 - в интервале - 3-20 мг/кг; ІЕМ-1460 - 1-10 мг/кг. Дозы пирацетама, карбацетама, спермина и глицина выбирали с учётом Методических рекомендаций по експериментальному изучению препаратов с ноотропным типом действия (М.: Медицина, 1989).
Таблица 2.1
Структура исследованных соединений
ШифрФормулаМолекулярная масса, гИЭМ-1460
1-триметил-аммонио-5-(1-адамантанметил-аммонио)пентан дибромид
454ИЭМ-1592
1-изопропил-диметиламмонио-5-(1-адамантан-метиламмонио) пентан дибромид
482ИЭМ-1755
1-аммонио-5-(1- адамантанаммонио) пентан дибромид
398ИЭМ-1490
1-адмантанметил-
аммонио-5-(1-ада-
мантанметиламмонио) гексан дибромид
574Мемантин
1-амино-3,5-ди-метиладмантан
215,8Аркаин
334Спермин
348
Антиамнестическую активность изучаемых веществ оценивали по способности сохранять выработанные условнорефлекторные поведенческие навыки (УРАИ и УРПИ) при их угашении амнезирующими факторами, в качестве которых использовали максимальный электрошок (50 Гц, 50 мА, 0,5 с), скополамина гидробромид (2 мг/кг, внутримышечно) и фокальную компрессионную ишемию головного мозга, выполненную по методике И.В. Барскова и И.И. Виктроова, (1994) Для оценки церебропротекторного и антиоксидантного действия исследуемых веществ использовалась методика неполной циркуляторной ишемии с последующим морфологическим и биохимическим исследованием мозга крыс.
Антиамнестическая активность исследуемых веществ изучалась в модели постэлектрошоковой амнезии, которая рассматривается в качестве базисной ''жёсткой'' модели экспериментально воспроизводимых нарушений памяти (П.Д. Шабанов и др., 1989). Эксперименты выполнялись по методике описанной в ''Методических рекомендациях по экспериментальному изучению препаратов с ноотропным типом действия'' (М.: Медицина, 1989), с небольшими модификациями.
У крыс вырабатывался УРАИ. Для его выработки применялась установка, позволяющая автоматизировать опыт и сделать минимальным контакт экспериментатора с животным. Использовали прямоугольную камеру размером 30X30X50 см, с металлическим электрифицированным полом. Расстояние между решётками пола составляет 1 см. Напряжение регулируется с помощью лабораторного латера. Установка снабжена реле времени, электрическим звонком и электросекундомером. На штативе укреплён деревянный стержень длиной 25 см, который свободно висит в центре камеры на высоте 10 см от пола. Подача электрического тока сопряжена с секундомером и звонком через реле времени.
Животное приносили из кафедрального вивария и помещали в установку на 2 мин для угасания ориентировочной реакции. Затем вырабатывался условный рефлекс избегания путём сочетания условного раздражителя (звонок, 15с) с последующим (через 5с от начала звучания звонка) электрическим раздражением лап (60В, 10с). В ходе дальнейших тренировок время между подачей звукового сигнала и нанесением болевого раздражения сокращалось с 5с до 3с. Тренировки производились в течение 2-3-х дней. Каждый день осуществлялось 3-4 сочетания условного и безусловного сигналов с промежутками между сигналами 5 мин.
Обучение происходило достаточно быстро. Длительные латентные периоды избегания наблюдались лишь в течение первых нескольких попыток, а начиная с четвёртого или пятого сочетания животное находилось в состоянии повышенной готовности к прыжку. Обычно 6-8 сочетаний было достаточно для выработки устойчивого УРАИ. Критерием выработанного навыка считался латентный период, не превышающий 5с. Латентный период рефлекса оценивался с помощью секундомера, который автоматически включался одновременно с подачей звукового сигнала и выключался при выпрыгивании крысы на стержень. Латентные периоды у большинства крыс составляли 1-3 с. Некоторым животным для обучения было достаточно 2-3-х сочетаний. В этом случае безусловный раздражитель использовался не в каждом сеансе. Такие животные считались обученными и использовались в опыте.
Основной опыт выполнялся на 3-4-ый день. В этот день однократно измеряли латентный период УРАИ, затем подавляли приобретенный условнорефлекторный навык максимальным электрошоком (МЭШ). Шок вызывали путём пропускания в течение 0,5 сек переменного электрического тока (50 Гц, 50 мА) через голову животного посредством наложенных битемпорально на кожу височных областей пластинчатых электродов, выполненных на зажимах типа ''крокодил''. Кожу крыс предварительно смачивали физиологическим раствором для улучшения проводи
- Київ+380960830922