РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріал дослідження.
Об'єктом експериментального дослідження були сім'яники 165 статевозрілих щурів-самців лінії "Вістар", масою 280-340 грам, що утримувалися в звичайних умовах віварію ВДНЗ України "Українська медична стоматологічна академія", згідно з "Правилами використання лабораторних експериментальних тварин", 1984, додаток 4 і Хельсінською декларацією про гуманне відношення до тварин.
Більшість робіт присвячених дослідженню морфології та функції сім'яників, виконані на щурах, тому і для нас було важливим співставити дані власних досліджень з результатами інших науковців. За своїми морфологічними ознаками сім'яники щурів найбільш подібні до сім`яників людини [96].
Для того, щоб виключити вплив на експеримент добового та сезонного ритмів біологічної активності та інших факторів, досліди проводились у літній період, завжди в ранковий час через 18 годин після останнього годування [30].
155 тварин використали для постановки гострих дослідів, які були направлені на отримання експериментальної моделі гострого асептичного запалення [254, 282, 290], шляхом внутрішньоочеревинного введення 5 мг ?-карагінену ("Sigma", США) в 1 мл ізотонічного розчину хлориду натрію - на одну тварину (55 тварин), з наступною корекцією його трансплантацією кріоконсервованої плаценти (55 тварин).
Карагінен являє собою сульфатизований глікозаміноглікан, який виділений з ірландського морського моху Chondrus і використовується як флогоген [4, 83, 84].
Плаценту заготовляли від соматично здорових донорів під час планової операції кесарева розтину в стерильних умовах з дотриманням всіх правил асептики і антисептики. Плаценту кріоконсервували за допомогою спеціальної програми, розробленої в Інституті проблем кріобіології та кріомедицини НАН України (м. Харків), згідно стандартів розроблених цим інститутом [59, 60, 109].
Після заморожування контейнери доставляли в банк кріоконсервованих препаратів, де вони зберігалися в рідкому азоті і його парах при температурі -1960C. Проводили додатковий контроль на наявність інфекційних агентів і оцінювали життєздатність деконсервованої плацентарної тканини. Перед трансплантацією фрагмента кріоконсервованої плаценти визначали герметичність і цілісність контейнера, у якому зберігався трансплантат, відповідність паспортизації та строків зберігання [50, 52].
Фрагмент плацентарної тканини перед трансплантацією розморожували на водяній лазні при температурі 38°С в умовах малої операційної віварію ВДНЗ України "Українська медична стоматологічна академія" з дотриманням всіх умов асептики й антисептики. Кріоконсервована плацента була розмірами 0,5х0,5х0,5 см, об`ємом - 0,125см3. Операційне поле попередньо обробляли розчином спирту і йоду, обкладали стерильними серветками. Після проведеного внутрішньом'язового наркозу гексеналом (з розрахунку на 1 кг маси тіла) на стегні щура шкіру розрізали довжиною 2см, відсепаровували підшкірну кишеню, в яку поміщали трансплантат. Розріз шкіри зашивали вузловими кетгутовими швами, на рану накладали асептичну пов'язку. Тварин піддавали евтаназії згідно термінів серії груп (табл.2.1),
2.2. Експериментальні моделі.
Досліджувані тварини були розподілені на чотири групи (табл.2.1).
Перша (І) група - інтактні тварини в кількості 10-и.
Друга (ІІ) група - 45 тварин, яким одноразово була проведена трансплантація кріоконсервованої плаценти.
Третя група (ІІІ) - 55 тварин, яким було змодельовано гострий асептичний орхіт шляхом внутрішньоочеревенного введення ?-карагінену.
Четверта (ІV) група - 55 тварин, яким на фоні асептичного запалення, викликаного внутрішньоочеревенним введенням ?-карагінену, провели
трансплантацію кріоконсервованої плаценти.
2.3. Методи дослідження.
Приготування препаратів. Після евтаназії тварин була проведена лапаротомія та видалені сім'яники. Після цього за допомогою гострого леза сім'яники розрізали на невеликі сегменти та фіксували їх в 1%-му розчині чотириокису осмію на 0,1 М фосфатному буфері з рН-7,4 - протягом 1,5-2 години з триразовою зміною розчину осмію. Після фіксації тканинні блоки відмивали від фіксатора 0,1 М фосфатним буфером з наступною дегідратацією в етиловому спирті зростаючої концентрації (30°, 50°, 70°, 90°, 100°) по 15 хв. з трикратною заміною спирту в кожній із порцій.
Після закінчення дегідратації матеріал пропускали через абсолютний спирт з абсолютним ацетоном (10 хвилин), через абсолютний ацетон (10 хвилин). В подальшому - через розведення ацетону з епоксидними смолами (3:1 - 30 хвилин; 1:1 - 1 годину); після цього матеріал знаходився 1 годину в чистій смолі. Потім шматочки матеріалу поміщали в желатинові капсули і заливали смолою, з наступною полімеризацією при температурі + 60° С протягом доби [2, 25, 110].
Напівтонкі зрізи готували на ультрамікротомі УМТП-7. Напівтонкі зрізи розташовували на предметному склі та фарбували 1% розчином метиленового синього.
Для об'єктивної оцінки дії пошкоджуючих чинників при асептичному запаленні, адаптаційно-відновних процесів після запалення та трансплантації кріоконсервованої плаценти на сперматогенний епітелій, мікроциркуляторне русло та інтерстиційну тканину сім`яників нами була проводена морфологічна оцінка змін сперматогенного епітелію, мікроциркуляторного русла та інтерстиційної тканини сім`яників за допомогою гістометрії [24, 25, 77, 78, 93, 245].
З цією метою на кожний строк було взято по п'ять тварин. Із правого та лівого сім'яників кожної тварини виготовляли по п'ять блоків, з яких виготовляли препарати. Морфологічну оцінку стану сперматогенного епітелію, кровоносного мікроциркуляторного русла та інтерстиційної сполучної тканини проводили за допомогою світлового мікроскопу "Carl Zeiss",