РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Контингент обстежених та досліджуваний матеріал
З метою реалізації поставлених у роботі завдань нами за період 1997-2005 років було обстежено 2543 хворих на опортуністичні інфекції. З них 1730 становили хворі на позалікарняні опортуністичні інфекції, обстежені при звертанні до поліклінічного відділу Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В.Громашевського АМН України (ІЕІХ), 370 ВІЛ-інфікованих осіб, які знаходилися на диспансерному обліку в клініці ІЕІХ та 407 госпіталізованих хворих з гнійно-запальними інфекціями, які перебували в клінічній лікарні №4 м. Києва у відділеннях хірургічного профілю та 36 хворих з реанімаційного, хірургічного та опікового відділень в лікарні швидкої допомоги м. Харкова. Загальну характеристику обсягу досліджень наведено в табл. 2.1.
Таблиця 2.1
Об'єкти та об'єми бактеріологічних досліджень
Контингент хворихКількість хворихКількість бактеріологічних дослідженьЗагальна кількість виділених штамів Кількість досліджень на чутливість до антибіотиківХворі на ПОІ17306920183321996ВІЛ-інфіковані хворі на опортуністичні інфекції37014804285136Госпіталізовані хворі з ГЗІ:
в м.Києві
в м.Харкові
407
36
1628
144
442
36
5304
432Всього254310172273932868
Матеріалом для досліджень у хворих на опортуністичні інфекції в залежності від локалізації патологічного процесу були: вміст гнійних вогнищ на шкірі, слиз із зіву, носу, мокротиння, сеча, виділенняз піхви, з церві кального каналу, жовч, виділення з очей, а у госпіталізованих хворих з ГЗІ також трахеальний аспірат, плевральна рідина, бронхоальвеолярний лаваж, гнійні виділення післяопераційних ран.
2.2.Методи дослідження біологічного матеріалу та ідентифікації збудників інфекцій
Забір матеріалу у хворих на опортуністичні та нозокоміальні інфекції та встановлення кількісного вмісту УПМ в досліджуваному матеріалі проводили загальноприйнятими методами [357].
Первинний посів біологічного матеріалу проводили на такі елективні та дифференційно-діагностичні середовища: 5% кров'яний агар, середовище Ендо, жовточно-сольовий агар (ЖСА), середовище Сабуро, сахарний бульон, мокротиння та слиз із зіву додатково - на шоколадний агар. Посів здійснювали кількісним методом секторного посіву за Голдом [358]. Обсіменіння досліджуваних субстратів визначалось для кожного окремого виду [359]. Після інкубації засіяних чашок з середовищами 24 год в термостаті при 370 С, а з Сабуро 48 год при 280 С, проводили облік росту колоній на поверхні середовищ, враховуючи забарвлення, консистенцію, розмір, наявність гемолізу на кров'яному агарі. З ізольованих колоній мікроорганізмів готували препарати, які фарбували за Грамом. В залежності від морфології та забарвлення за Грамом, ізольовані колонії розсівали на селективні та диференційно-діагностичні поживні середовища, отримували чисту культуру і подальшу ідентифікацію проводили до виду і типу загальноприйнятими методами. [357].
В деяких випадках для остаточної ідентифікації ентеробактерій використовували пластини для біохімічної ідентифікації - ПБДЕ, виробництва НВО "Диагностические системы", Російська Федерація та ЕНТЕРОтест24, виробництва PLIVA-lachema, Чехія, бактерій роду Staphylococcus - пластини для біохімічної ідентифікації стафілококів (ПБДС, виробництва НВО "Диагностические системы", Російська Федерація) та за допомогою СТАФИтеста 16 (виробництва PLIVA-lachema, Чехія); неферментуючих бактерій родів Pseudomonas та Acinetobacter - тест-систем API 20 NE, виробництва фірми BioMerieux, Франція та микротест-систем НЕФЕРМтест24, виробництва PLIVA-lachema, Чехія [360].
Ідентифікацію ентерококів проводили за їх здатністю рости в присутності телуриту калію та ферментувати сорбіт, сахарозу, арабінозу та рамнозу. Культури ентерококів, які росли в присутності 0,04% телуріту калію та ферментували сорбіт, сахарозу, рамнозу (+) відносили до Е.faecalis. Ті, що не росли на середовищі із телуритом калію, не ферментували сорбіт і рамнозу, але ферментували арабінозу та сахарозу (+) відносили до E.faecium.
При ідентифікації стрептококів вивчали колонії на чашках з 5% кров'яним агаром, відмічали вид гемоліза, проводили каталазний тест. При відсутності у виділених мікроорганізмів каталазної активності та наявності в препаратах, забарвлених за Грамом клітин, характерних для стрептококів, робили висіви в поживний бульон з сироваткою (10%) великої рогатої худоби. Після інкубації на протязі 24 годин в термостаті при 370С відмічали характер росту в рідкому середовищі. Колонії, які утворювали при рості на 5% кров'яному агарі ?-гемоліз схожі на S.pyogenes, тестували на чутливість до низьких концентрацій бацитрацину за допомогою діагностичного диска з вмістом бацитрацину 0,04 ОД ( виробництва PLIVA-lachema, Чехія).
Колонії з ?-гемолізом за морфологією схожі на S.pneumoniae відсівали на 5% кров'яний агар і визначали чутливість до оптохіну (за допомогою дисків з оптохіном, виробництва PLIVA-lachema, Чехія ) та лізис в присутності солей жовчних кислот.
Для ізоляції бактерій роду Haemophilus використовували шоколадний агар. Посіви інкубували при 370 С в атмосфері з 5-10% СО2 (ексікатор з запаленою свічкою) на протязі 24 год. Після отримання чистої культури вивчали потребу в Х і V факторах (за допомогою дисків з Х,V і Х+V факторами, виробництва PLIVA-lachema, Чехія), каталазну, оксидазну активність, наявність ферментів уреази та ?-галактозідази, утворення індолу.
Для визначення дріжджоподібних грибів роду Candida досліджуваний біологічний матеріал засівали на агар Сабуро із додаванням антибіотиків (гентаміцин - у концентрації 0,1 г/л; тетрациклін - 0,1г/л або хлорамфенікол - 0,11 г/л) і культивували при 28 0С в продовж 2 - 7 діб. Чисті культури висівали на чашки Петрі з ідентифікаційним середовищем "Candida-ID" ("BioMerіеuх", Франція), на якому через 48 год при 37 0С колоніії C. albicans мали блакитний колір, C.tropicalis, C. lusitaniae, C. guille